張亞妮 方偉 王開梅 張志剛 王燕 萬中義 吳兆圓

摘要：篩選到一株具有農(nóng)藥活性的真菌NBERC-170301，通過活性跟蹤，確定出其中的活性組分。并經(jīng)過大量發(fā)酵，提取分離得到4個(gè)化合物，經(jīng)超高效液質(zhì)聯(lián)用（UPLC-MS）和NMR確定其中3個(gè)化合物分別為青霉酸、郝金青霉素和郝青霉素酮，活性測(cè)試結(jié)果表明，化合物4對(duì)小菜蛾具有較好的毒殺活性，但結(jié)構(gòu)暫未確定。

關(guān)鍵詞：真菌NBERC-170301;農(nóng)藥活性;青霉酸;郝金青霉素;郝青霉素酮

中圖分類號(hào)：TQ450.1? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）22-0060-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.22.017? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Fungus NBERC-170301 which had pesticide activity was found. By active tracking，the active fractions were detected，and 4 compounds were obtained（1-4）. Compounds 1-3 were identified as penicillic acid（1），herqueichrysin（2） and herqueinone（3） by UPLC-MS and NMR. The results of biological activity showed that compound 4 had insecticidal activity against the Plutella xylostella L.，however，the structure of which was failed to be identified.

Key words： fungus NBERC-170301; pesticide activity; penicillic acid; herqueichrysin; herqueinone

真菌分布廣泛，從陸地到海洋，從動(dòng)物到植物，乃至其他微生物，幾乎都有真菌的存在。正是由于真菌的物種多樣性與生態(tài)環(huán)境的多樣性導(dǎo)致了其次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和生物活性的多樣性，因而一直以來都是先導(dǎo)化合物的重要來源之一[1，2]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，已有8 600多種活性代謝產(chǎn)物分離自真菌，具有多種結(jié)構(gòu)類型。從1940年的僅10多個(gè)化合物到2002年超過22 000個(gè)化合物，期間具有活性代謝產(chǎn)物的數(shù)量呈指數(shù)倍地不斷增長[3]。臨床上廣泛使用的青霉素、洛伐他汀、環(huán)孢素以及棘白霉素等藥物，都是真菌次生代謝產(chǎn)物或其衍生物[4]。

湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心擁有豐富的微生物資源，在抗菌活性真菌的篩選過程中，篩選到一株具有農(nóng)藥活性的真菌NBERC-170301，通過活性跟蹤，確定出其中的活性組分?，F(xiàn)將試驗(yàn)報(bào)告如下。

1? 材料與方法

1.1? 菌株

1.1.1? 抗生素產(chǎn)生菌? 編號(hào)為真菌NBERC-170301，在武漢市的土樣中分離得到，由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心保存。

1.1.2? 生測(cè)指示菌? 番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）、小麥穎枯病菌（Septoria nodorum）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）均為湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心保存。

1.1.3? 供試?yán)ハx? 小菜蛾（Plutella xylostella L.）初孵幼蟲、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）初孵幼蟲、蚜蟲（Aphidoidea）均由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心提供。

1.2? 培養(yǎng)基

1.2.1? 種子培養(yǎng)基? 麥芽糖6.25 g，麥芽提取物6.25 g，酵母提取物1.00 g，磷酸二氫鉀1.25 g，硫酸鎂0.625 g，蛋白胨0.625 g，瓊脂粉15.00 g，去離子水1 000 mL。

1.2.2? 發(fā)酵培養(yǎng)基? 葡萄糖72.00 g，蛋白胨8.00 g，酵母提取物4.00 g，磷酸二氫鉀2.00 g，硫酸鎂1.00 g，鹽酸硫胺0.10 g，pH 6.0，去離子水1 000 mL。

1.2.3? 生測(cè)培養(yǎng)基? 采用（PDB+瓊脂）半固體培養(yǎng)基，馬鈴薯（去皮）200 g， 葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，去離子水1 000 mL，自然pH。

1.3? 儀器與試劑

1.3.1? 儀器? Bruker AVANCE（500 MHz）核磁共振儀（TMS為內(nèi)標(biāo)）（德國Bruker BioSpin公司）;BUCHI ROTAVAPOR R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士）;Water 2695高效液相色譜儀（Waters 2996二級(jí)管陣列檢測(cè)器，色譜工作站MasslynxV4.0）;高效制備液相色譜儀（Waters2525泵，帶2767自動(dòng)收集系統(tǒng)，Waters2996二級(jí)管陣列檢測(cè)器，色譜工作站MasslynxV4.0）;液質(zhì)聯(lián)用儀：Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)，美國Micromass Quattro Micro？誖質(zhì)譜儀電噴霧離子源（ESI），Masslynx V4.1液質(zhì)聯(lián)用分析軟件。

2.3? 化合物的活性測(cè)試

按照“1.5.5”的方法對(duì)4個(gè)化合物進(jìn)行殺蟲、殺菌的活性測(cè)試?；衔?在濃度20 mg/L下僅對(duì)水稻紋枯病原真菌具有較弱的抑制作用，但無殺蟲活性。化合物2、化合物3在3個(gè)濃度梯度下均無殺蟲、殺菌活性?；衔?在濃度1 000 mg/L、500 mg/L下對(duì)小菜蛾具有較好的毒殺活性，但對(duì)棉鈴蟲和蚜蟲無活性，且無殺菌活性。

3? 小結(jié)與討論

篩選到一株活性真菌NBERC-170301，經(jīng)分離純化得到4個(gè)化合物，通過NMR數(shù)據(jù)分析，確定其中的3個(gè)化合物分別為青霉酸[Penicillic acid（1）]、郝金青霉素[Herqueichrysin（2）]和郝青霉素酮[Herqueinone（3）]，化合物3以一對(duì)構(gòu)象異構(gòu)體呈現(xiàn)?；衔?對(duì)小菜蛾具有較好的毒殺活性。

青霉酸主要是由軟毛青霉、圓弧青霉、馬頓青霉、托姆青霉、徘徊青霉、棒形青霉以及棕曲霉等產(chǎn)生的多聚乙酰類霉菌毒素。有關(guān)青霉酸的研究較多，青霉酸不僅具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤以及抑制乙酰膽堿酶的活性，且對(duì)各種動(dòng)物都具有毒性，主要引起心臟、肝臟和腎臟等器官的損傷，并具有潛在致癌性[11-13]。此外，青霉酸是一種真菌群體效應(yīng)抑制劑（QSI），近期人們對(duì)50種青霉屬真菌進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)66%的菌株能產(chǎn)生具有QSI活性的次生代謝產(chǎn)物，其中的兩種主要次生代謝產(chǎn)物為青霉酸和棒曲霉素，以銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）為例，青霉酸和棒曲霉素能夠?qū)︺~綠假單胞菌中群體效應(yīng)控制的基因進(jìn)行抑制，其中青霉酸的抑制率高達(dá)60%[14]，考慮到青霉酸本身的毒性，或許進(jìn)行修飾變成無毒的衍生物之后可以成為抗感染的藥物。郝金青霉素是一種新的芴酮抗生素，Narasimhachari等[8]研究表明，郝金青霉素在青霉屬Penicillinm herquei strain I菌株靜止培養(yǎng)的菌絲體中分離得到;濃度為1 μg/mL時(shí)可抑制枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌生長。有關(guān)郝青霉素酮的研究報(bào)道較少?；钚詼y(cè)試結(jié)果表明，化合物4對(duì)小菜蛾具有較好的毒殺活性，但其結(jié)構(gòu)中所含手型分子暫未確定，進(jìn)一步將會(huì)繼續(xù)對(duì)化合物4進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，以便找到活性好的化合物。

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