趙 暉

（遼寧省大連市普蘭店區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 大連 116200）

獸醫(yī)實驗室中，常利用血凝和血凝抑制試驗，對禽流感、新城疫等具有血凝性的病毒進行鑒定或?qū)Πl(fā)病禽群進行疫病診斷、對禽群的免疫狀態(tài)進行評價等。

1 定義與原理

1.1 血凝

某些病毒或病毒的血凝素，能選擇性的使某種或某幾種動物的紅細胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細胞的現(xiàn)象稱為血凝。

1.2 血凝抑制

當病毒的懸液中先加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆?；蚱溲貢r，則紅細胞表面的受體就不能與病毒顆粒或其血凝素直接反應(yīng)，也稱血凝抑制反應(yīng)。

2 血凝和血凝抑制試驗的操作細節(jié)

自備器材、試劑；領(lǐng)取病毒抗原、標準陽性血清、標準陰性血清；制備1%雞紅細胞；血凝試驗，判定；4HAU回滴；稀釋抗原；血凝抑制試驗；判定結(jié)果。

2.1 自備器材、試劑

96孔V型反應(yīng)板，微量移液器、阿氏液、pH7.2 0.01mol/L PBS液。

2.2 領(lǐng)取抗原

領(lǐng)取禽流感或新城疫抗原及相對應(yīng)的標準陽性血清、標準陰性血清。

2.3 1%雞紅血球的制備

取3只或3只以上SPF公雞或無禽流感和新城疫等病原感染的的健康公雞的血液與阿氏液等體積混勻，用PBS液（pH7.2、0.01mol/L）反復(fù)洗滌3次，每次以 2000轉(zhuǎn) /min（用于新城疫抗體檢測)）或1000轉(zhuǎn)/min（用于禽流感抗體檢測）離心10min，洗滌后的紅血球與PBS液混合均勻，配置成1%的紅細胞懸液，置4℃冰箱冷藏。

2.4依據(jù)GB/T18936-2003高致病性禽流感診斷技術(shù)、GB/T16550-2008新城疫診斷技術(shù)進行血凝試驗、4HAU回滴、稀釋抗原、血凝抑制試驗的操作。

2.5 HI結(jié)果判定

以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。陰性對照孔血清滴度小于或等于2log2，陽性對照孔血清不超過1個滴度的誤差，作為實驗成立的先決條件。以禽流感為例，HI≤3log2判定HI試驗結(jié)果為陰性；HI價＝4log2試驗結(jié)果為可疑，需要重復(fù)試驗，HI≥5log2試驗結(jié)果為陽性。

3 血凝與血凝抑制試驗注意事項

3.1 4HAU抗原最好現(xiàn)用現(xiàn)配制

3.2 抗原滴加的順序

每次向板內(nèi)滴加抗原時，移液器滴頭要與平面45度懸空，不要觸碰到孔內(nèi)的液體，由后向前依次滴加（即濃度由低往高滴加）。

3.3 抗原抗體反應(yīng)時間

抗原抗體在室溫20～25℃下，必須反應(yīng)30min以上，若環(huán)境溫度低于室溫，可將微量反應(yīng)板置于恒溫培養(yǎng)箱中，使二者充分反應(yīng)。

3.4 磷酸鹽緩沖液的PH值

磷酸鹽緩沖液的pH值要在高壓滅菌后進行滴定，往往在高壓后pH值會有所改變，所以高壓后再調(diào)一次pH值更為準確。磷酸鹽緩沖液一經(jīng)使用保存期不要超過3周。當pH＜5.8時，紅細胞會產(chǎn)生自凝現(xiàn)象；當pH＞7.8時，圖形洗脫加快，易造成肉眼觀察產(chǎn)生誤差；pH＝7.2時，紅細胞沉降最充分，圖形最清晰。

3.5 采血雞的只數(shù)要求3只以上

將雞血放置于15mL離心管內(nèi)進行洗滌，避免使用1.5～2mL離心管洗滌。

3.6滴加1%紅細胞懸液時，要經(jīng)?；蝿蛹t細胞懸液，使紅細胞均勻分散在磷酸鹽緩沖液中，防止紅細胞下沉。

3.7 判定時間

加入雞紅血球之后，反應(yīng)板在室溫（20～25℃）靜置30～40min，對照孔血球下沉于孔底，即可判定結(jié)果。若室溫達不到實驗要求，需相應(yīng)調(diào)整反應(yīng)時間。當環(huán)境溫度低于4℃時，紅細胞發(fā)生自凝；高于37℃時，會發(fā)生反應(yīng)物分離和紅細胞溶血。

3.8檢測禽流感抗體時，洗滌雞紅細胞離心轉(zhuǎn)數(shù)為：1000 RPM，離心10min；檢測新城疫抗體時，洗滌雞紅細胞離心轉(zhuǎn)數(shù)為：2000 RPM，離心10min；1000 RPM和2000 RPM離心轉(zhuǎn)數(shù)離心雞紅細胞壓積不一樣，導(dǎo)致1%雞紅細胞濃度不一樣，影響檢測結(jié)果。