胚胎停育和人流后組織中基因變化分析

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【摘 要】目的：通過運(yùn)用高通量測序技術(shù)來研究染色體異常所導(dǎo)致的流產(chǎn)遺傳機(jī)制，并探尋胚胎停止發(fā)育和絨毛組織中染色體發(fā)生異常的相關(guān)危險(xiǎn)因素，有利于科學(xué)的干預(yù)、指導(dǎo)育齡期女性出現(xiàn)胚胎停止發(fā)育的現(xiàn)象。方法：采集發(fā)生胚胎停育的94名患者的流產(chǎn)后絨毛組織（2017年5月至2018年5月，山東省東營市勝利石油管理局勝利醫(yī)院婦科），標(biāo)本培養(yǎng)后運(yùn)用高通量測序技術(shù)對染色體進(jìn)行核型分析。結(jié)果：收集標(biāo)本全部培養(yǎng)成功，檢測結(jié)果中染色體結(jié)構(gòu)異常5例；染色體數(shù)目異常37例；異常核型49例。結(jié)論：染色體異常是導(dǎo)致胚胎停育的重要原因。及時(shí)發(fā)現(xiàn)并治療，對優(yōu)生優(yōu)育有重大意義。

【關(guān)鍵詞】胚胎停育；絨毛組織；高通量測序

【中圖分類號】R394.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1005-0019（2018）23--01

高通量測序（High-Throughput Sequencing）又稱下一代測序（Next Generation Sequencing，NGS），是相對于傳統(tǒng)的桑格測序（Sanger Sequencing）而言的。高通量測序技術(shù)具有高解析度、高輸出量的特性，極大的減少了測序的費(fèi)用和時(shí)間，發(fā)現(xiàn)核型分析技術(shù)檢測不到的CNV。作為疾病的一項(xiàng)生物學(xué)標(biāo)志，染色體的擴(kuò)增和缺失等變化，已經(jīng)成為許多疾病的研究熱點(diǎn)。異常DNA拷貝數(shù)變異（CNV，Copy number variations）是導(dǎo)致人類許多疾?。ㄟz傳性疾病、癌癥等）的重要分子機(jī)制。致病性的CNV可以導(dǎo)致胚胎停育，如果發(fā)現(xiàn)該類CNV，即可告知孕婦（自然受孕很難得到健康的孩子）需要進(jìn)行輔助生殖技術(shù)受孕，對實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育具有極其重大的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取發(fā)生胚胎停育的94名患者（2017年5月至2018年5月，山東省東營市勝利石油管理局勝利醫(yī)院婦科），經(jīng)手術(shù)清宮或藥物流產(chǎn)后，收集的94例絨毛組織標(biāo)本作為研究對象。采集標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡：23-43歲（其中高齡孕婦16人，試管嬰兒5人）；孕周：6-10周（均為單胎妊娠）。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者對本組研究完全知情同意，均明確為胚胎停育；超聲檢查無原始血管波動(dòng)，無胚芽[1]。排除標(biāo)準(zhǔn)：感染因素患者；家族遺傳史；免疫功能異常；凝血機(jī)制障礙[2]。

1.2 研究方法

1.2.1 采集樣本情況：患者均因胚胎停育行清宮術(shù)或藥物流產(chǎn)終止妊娠，終止妊娠后采集標(biāo)本量不低于10mg的絨毛組織。

1.2.2 母體污染觀察：將絨毛用生理鹽水反復(fù)沖洗5-10次，沖洗（母血及污染物）干凈直至沒有明顯紅色血樣污染物為止。

1.2.3 樣本保存溫度為冷凍狀態(tài)，運(yùn)輸條件為低溫運(yùn)輸。

1.2.4 DNA降解情況需要注意，采集樣本后需要盡快冷凍運(yùn)輸，避免時(shí)間間隔過長，發(fā)生DNA降解。

觀察并記錄培養(yǎng)成功的標(biāo)本，統(tǒng)計(jì)分析標(biāo)本的絨毛細(xì)胞核型，根據(jù)絨毛標(biāo)本是否存在異常核型來進(jìn)行分組，并用高通量測序技術(shù)來分析胚胎停育的染色體異常類型及常見絨毛組織的異常核型的差異。高通量測序：收集新鮮冷凍的流產(chǎn)組織物，取絨毛組織10mg（不少于10mg），從中提取基因組DNA。（1）基因組DNA的片段化：使用超聲打斷儀，將提取的基因組DNA打斷成小片段的核酸。（2）DNA小片段文庫構(gòu)建：用打斷后的小片段核酸作為起始模板，構(gòu)建文庫。主要過程：用酶反應(yīng)法將小片段核酸的5′端突出末端補(bǔ)平，或?qū)?′端突出末端削平后用T4 DNA 連接酶連接在DNA片段兩端，回收合適范圍的片段。用PCR擴(kuò)增法富集。再次進(jìn)行片段選擇、純化。（3）測序：將DNA文庫進(jìn)行測序。使用的儀器：IlluminaHiSeq2500 測序平臺。（4）分析：將高通量測序結(jié)果通過比對軟件將每個(gè)測序Reads匹配到其所在的染色體上。隨后做相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化Z值分析，通過Z 值進(jìn)行染色體異常判定[3]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，以（）表示計(jì)量資料；比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用字檢驗(yàn)；以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 絨毛組織培養(yǎng)結(jié)果：將94例胚胎停育患者的絨毛標(biāo)本進(jìn)行長期細(xì)胞培養(yǎng)，成功率達(dá)100%。其中檢出正常核型45例，正常率達(dá)47.9%；異常核型49例，異常率達(dá)52.1%。

2.2 絨毛細(xì)胞異常核型的類型分析：對檢出的49例標(biāo)本進(jìn)行染色體的異常類型分析：檢出常染色體三體的異常率47.06%（16/34），明顯高于三倍體20.59%（7/34）、四倍體8.82%（3/34）、嵌合體 8.82%（3/34）、性染色體單體 8.82%（3/34）及結(jié)構(gòu)異常5.88%（2/34）等類型檢出率，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

二胎政策開放以來，很多高齡孕婦在患有高血壓、糖尿病、瘢痕子宮等情況下受孕，且年齡逐漸增高。相關(guān)數(shù)據(jù)表示，造成胚胎停育的主要因素有感染、免疫、內(nèi)分泌及遺傳等因素，其中遺傳因素占最主要因素，約60%以上的胚胎停育患者是胎兒染色體異常所致。遺傳因素致使的胚胎停育，不僅造成本次妊娠的不良結(jié)局，也對患者今后的妊娠帶來不同程度的影響。因此明確胚胎停育的原因?qū)φＨ焉锞哂兄匾饬x。對下一次妊娠進(jìn)行有效的科學(xué)指導(dǎo)，避免過度使用藥物進(jìn)行備孕。

絨毛組織的染色體結(jié)構(gòu)、物遺傳特性、胎兒的染色體結(jié)構(gòu)等基本一致，且絨毛組織的細(xì)胞分裂能力強(qiáng)。對采集的絨毛細(xì)胞用相應(yīng)的體外培養(yǎng)手段集取足夠的處于分裂中期的絨毛細(xì)胞進(jìn)行分析、研究胚胎的遺傳學(xué)。

本組研究應(yīng)用消化培養(yǎng)法獲取絨毛細(xì)胞染色體的分裂相。應(yīng)用高通量測序分析絨毛細(xì)胞異常核型的構(gòu)成，提示絨毛細(xì)胞異常核型最常見的類型是常染色體三體，且正常遺傳物質(zhì)的異常染色體的主要表現(xiàn)形式：斷裂、倒置、移位等的結(jié)構(gòu)異常；單倍體、三倍體及多倍體等的數(shù)目異常。胚胎停育染色體主要的絨毛細(xì)胞異常核型類型是數(shù)目異常，其中常染色體三體異常最為常見。胚胎在受精卵早期卵裂、性細(xì)胞成熟的過程中，因多種遺傳因素造成染色體異常分離，導(dǎo)致染色體數(shù)目異常。染色體數(shù)目增多形成數(shù)目異常的染色體三體、三倍體等。通過對患者進(jìn)行多方面的檢查明確是否因內(nèi)分泌、環(huán)境、免疫等方面的影響因素導(dǎo)致胚胎停育，進(jìn)而在下次或以后的妊娠中避免這些影響因素[4]。

本組研究提示，產(chǎn)前進(jìn)行遺傳學(xué)細(xì)胞核型分析，對保證妊娠安全起重要作用。通過培養(yǎng)絨毛細(xì)胞、應(yīng)用高通量測序技術(shù)、分析絨毛細(xì)胞核型、判斷胚胎染色體是否異常、進(jìn)一步分析核型的異常類型（重點(diǎn)警惕染色體數(shù)目異常，尤其是常染色體三體異常的絨毛細(xì)胞），對染色體異常的患者應(yīng)及時(shí)給予干預(yù)或終止妊娠，避免發(fā)生不良妊娠結(jié)局。對于已發(fā)生胚胎停育的患者，若檢出絨毛細(xì)胞異常核型應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的患者遺傳學(xué)分析，明確導(dǎo)致絨毛細(xì)胞核型即胚胎核型異常的原因，正常絨毛細(xì)胞胚胎停育的患者則需通過免疫因素、內(nèi)分泌因素、環(huán)境因素等進(jìn)行多方面分析，明確導(dǎo)致胚胎停育的非遺傳影響因素，進(jìn)而通過針對性干預(yù)措施降低再次妊娠的胚胎停育發(fā)生率[5-8]。

4 結(jié)論

胚胎停止發(fā)育的原因（感染、免疫異常、染色體異常等）復(fù)雜。傳統(tǒng)的絨毛組織培養(yǎng)，染色體核型分析方法只能檢測10Mb以上片段的重復(fù)、缺失，無法檢測出微小的片段缺失和片段重復(fù)，而高通量測序可以檢出200kb以上的片段重復(fù)和片段缺失。應(yīng)用高通量測序技術(shù)分析絨毛染色體的核型，可以有效的明確患者胚胎停育的原因。

綜上所述，結(jié)合高通量測序技術(shù)有利于對早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防以及早治療，對于既往有過胚胎停育史育齡期婦女，應(yīng)進(jìn)行相關(guān)的檢查。盡早篩查、明確病因、避免漏診，便于及時(shí)針對性的采取積極措施，有效減少胚胎停育的發(fā)生，對優(yōu)生優(yōu)育有重大意義。

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