羅 濤，彭細(xì)娟，楊彥龍

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西西安 710038 1神經(jīng)外科；2重癥醫(yī)學(xué)科

神經(jīng)膠質(zhì)瘤亦被稱作膠質(zhì)細(xì)胞瘤，簡稱為膠質(zhì)瘤，主要發(fā)生于神經(jīng)外胚層，是一種常見的惡性腫瘤，占所有顱內(nèi)腫瘤的35.26% ～ 60.96%[1]。膠質(zhì)瘤的常見分類有星形細(xì)胞瘤、星形母細(xì)胞瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤等[2]。因其多呈浸潤性生長，并與正常腦組織無明顯分界，故具有“三高一低”的特點(diǎn)，即發(fā)病率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高及治愈率低[3]。到目前為止，針對膠質(zhì)瘤的治療仍以手術(shù)為主(顯微外科手術(shù)、神經(jīng)導(dǎo)航手術(shù)、術(shù)中熒光實(shí)時導(dǎo)航下膠質(zhì)瘤切除術(shù))，并輔以放療和化療[4]。然而腫瘤細(xì)胞對放療的輻射耐受程度可能引起殘余病灶再次復(fù)發(fā)，這使其至今仍是治療困難、預(yù)后最差的一類中樞系統(tǒng)腫瘤[5-6]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸的無編碼功能的RNA分子。最初有研究者認(rèn)為其是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具備生物學(xué)功能[7]。但目前多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)lncRNA可以在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞的不同生物學(xué)進(jìn)程，包括細(xì)胞周期、基因穩(wěn)定性及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等，而且在一系列不同類型的細(xì)胞和疾病中發(fā)揮著重要的作用。這表明長鏈非編碼RNA對細(xì)胞功能的調(diào)控幾乎無處不在[8-9]。核仁小分子RNA宿主基因(SNHG)是對惡性腫瘤具有重要生物學(xué)調(diào)控作用的一類長鏈非編碼RNA[10-11]。其中的SNHG3，也稱為U17的宿主基因(U17HG)，位于1號染色體短臂3區(qū)6號帶。先前有相關(guān)研究表明，lncRNA SNHG3的表達(dá)可能在肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12-13]。然而，目前有關(guān)SNHG3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中作用的研究極少，其在膠質(zhì)瘤中表達(dá)的臨床意義尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時熒光定量技術(shù)，通過檢測SNHG3在70例不同級別膠質(zhì)瘤組織和30例正常腦組織中的表達(dá)水平差異，分析SNHG3在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)與膠質(zhì)瘤臨床病理因素之間的相關(guān)性，并分析SNHG3對膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后價值。

資料和方法

1 資料 采集空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科自2008年6月- 2013年6月收治的70例腦膠質(zhì)瘤患者臨床資料和腫瘤組織樣本，同時采集同期入院進(jìn)行顱腦外科手術(shù)的30例病例正常腦組織進(jìn)行對照。所有樣本的獲取符合空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會的協(xié)議，參與到本研究的患者均已簽署知情同意書。入選患者經(jīng)手術(shù)病理學(xué)確診，組織病理采集前患者均未進(jìn)行放、化療治療或其他抗癌治療。入選患者年齡在25 ～ 75歲，平均年齡為50歲，年齡＜50歲30例，≥50歲40例；其中男性32例，女性38例；KPS評分≥80分27例，＜80分43例；腫瘤直徑＜4 cm 26例，≥4 cm 44例；單發(fā)腫瘤33例，多發(fā)腫瘤37例；術(shù)后復(fù)發(fā)34例，未復(fù)發(fā)36例。按照WHO(2007年)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類的標(biāo)準(zhǔn)分級：Ⅰ級～Ⅱ級29例，Ⅲ級～Ⅳ級41例。

2 提取RNA以及SNHG3檢測 將證實(shí)有腫瘤細(xì)胞存在的膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本和正常腦組織標(biāo)本進(jìn)行脫蠟處理，采用Trizol法(Invitrogen，CA，USA)提取組織標(biāo)本中的總RNA。用紫外分光光度計(jì)測定組織標(biāo)本在波長為260 nm以及280 nm處的吸光度比值，計(jì)算RNA濃度并評估純度，選取OD值在1.9 ～ 2.0的RNA樣品。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后應(yīng)用RT-PCR法分別檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織標(biāo)本中SNHG3的表達(dá)水平，內(nèi)參基因設(shè)置為GAPDH。SNHG3擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s，隨后95℃、5 s，60℃、34 s，共40個循環(huán)。引物及探針序列，SNHG3上游引物正向：5'-CAGTGGTCGCTTCTTCT CCTT-3'，下游引物反向：5'-GGCATGAAATGCAC CTCAAT-3'，GAPDH上游引物正向：5'-TGTTGCC ATCAATGACCCCTT-3'，下游引物反向：5'-CTCCA CGACGTACTCAGCG-3'。所有qRT-PCR的引物特異性和效率性均經(jīng)過檢驗(yàn)。使用2-ΔΔCt相對定量方法計(jì)算倍數(shù)變化，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

3 隨訪 術(shù)后對患者進(jìn)行3個月1次的定期隨訪，短期隨訪主要以門診復(fù)診形式進(jìn)行，遠(yuǎn)期隨訪主要以電話隨訪形式進(jìn)行。隨訪截止時間為2018年6月。隨訪內(nèi)容為一般資料、KPS評分以及術(shù)后是否復(fù)發(fā)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS22.0(SPSS Inc，Chicago，IL，USA)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以-x±s表示，組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)；參數(shù)資料分析采用χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較用log-rank檢驗(yàn)，應(yīng)用單因素和多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型評估膠質(zhì)瘤患者不同臨床病理特征與臨床預(yù)后之間的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中SNHG3表達(dá)水平高于正常腦組織 RT-PCR的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNHG3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平與正常腦組織相比明顯上調(diào) (2.764±0.280 vs 1.000±0.297，P=0.001)。同時數(shù)據(jù)顯示，SNHG3的表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增高而增高(WHOⅠ～Ⅱ級2.110±0.291 vs WHOⅢ～Ⅳ級3.418±0.299，P=0.011)，提示其表達(dá)水平與腫瘤的病理級別呈正相關(guān)。見圖1。

2 SNHG3的表達(dá)與膠質(zhì)瘤臨床病理指標(biāo)的關(guān)系SNHG3的平均表達(dá)水平為2.764±0.280(1.207 ～4.361)，以SNHG3在膠質(zhì)瘤組織樣本中的表達(dá)水平平均值為界值將神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者分成兩組：SNHG3高表達(dá)組(n=42)和SNHG3低表達(dá)組(n=28)，結(jié)果顯示神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)水平的SNHG3與患者的年齡(P=0.622)、性別(P=0.557)、腫瘤大小(P=0.840)以及腫瘤數(shù)目(P=0.171)等因素?zé)o關(guān)，而與高組織學(xué)分級(P=0.007)、低KPS評分(P=0.009)以及患者術(shù)后復(fù)發(fā)(P=0.008)有一定關(guān)系。見表1。

3 SNHG3表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者術(shù)后預(yù)后的關(guān)系

分別用Kaplan-Meier繪制SNHG3低表達(dá)組和高表達(dá)組的生存曲線，用log-rank進(jìn)行生存率檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNHG3表達(dá)高者術(shù)后預(yù)后明顯較差，5年生存率顯著低于低表達(dá)者(高表達(dá)組31.4% vs低表達(dá)組63.0%，P=0.012)，提示SNHG3可能成為預(yù)測膠質(zhì)瘤預(yù)后的指標(biāo)。見圖2。4 SNHG3的表達(dá)與膠質(zhì)瘤臨床病理指標(biāo)的單因素和多因素分析 為了探究影響預(yù)后的獨(dú)立因素，我們首先將之前統(tǒng)計(jì)的相關(guān)臨床病理指標(biāo)與生存率進(jìn)行了單因素分析，然后將單因素分析結(jié)果中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)進(jìn)行多因素COX回歸分析，結(jié)果表明膠質(zhì)瘤組織的SNHG3高表達(dá)、高病理級別、KPS評分＜80分以及術(shù)后復(fù)發(fā)均是影響膠質(zhì)瘤患者術(shù)后預(yù)后的獨(dú)立危險因素。見表2。

表1 LncRNA-SNHG3表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者各臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性Tab. 1 Correlation between lncRNA-SNHG3 expression level and clinicopathological indicators in glioma patients (n, %)

圖1 LncRNA-SNHG3在正常腦組織和神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平Fig. 1 Expression level of lncRNA-SNHG3 in normal brain tissue and glioma tissue

圖2 LncRNA-SNHG3高表達(dá)組和低表達(dá)組患者術(shù)后生存率比較Fig. 2 Comparison of postoperative survival rates between lncRNASNHG3 high-expression group and low-expression group

表2 膠質(zhì)瘤患者不同臨床病理變量與生存率的單變量和多變量分析Tab. 2 Univariate and multivariate analyses of different clinicopathologic variables and survival rates in glioma patients

討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中惡性程度最高的原發(fā)腫瘤，其具有侵襲力強(qiáng)、易復(fù)發(fā)、預(yù)后差等特點(diǎn)，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中位生存期僅為1年左右[14]。因其多呈浸潤性生長，手術(shù)很難識別出真正的腫瘤邊界，故目前已有的治療方式效果并不是很理想，復(fù)發(fā)率較高[15]。為了尋找到一種新的可靠的可預(yù)測膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記物，我們進(jìn)行了相關(guān)研究，希望能尋找到一種新的分子標(biāo)簽，為今后膠質(zhì)瘤的早期診斷以及評價預(yù)后提供新的方法。

大量研究證實(shí)，在腫瘤組織中異常表達(dá)的lncRNA可影響腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)如細(xì)胞的增殖、分化或者凋亡[16]。這提示一些lncRNA可能作為腫瘤發(fā)生潛在的生物學(xué)標(biāo)記物以及治療靶點(diǎn)。潘俊辰等[17]的實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)，lncRNA loc285194在膠質(zhì)瘤樣本中低表達(dá)且與腫瘤的惡性程度存在相關(guān)性，上調(diào)loc285194的表達(dá)對于膠質(zhì)增殖的影響可能是通過激活其凋亡相關(guān)通路發(fā)生，而且腦膠質(zhì)瘤的生成可能與loc285194的表達(dá)缺失有關(guān)。此外丁一等[18]的實(shí)驗(yàn)表明SPRY4-IT1在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)量高于瘤周組織，其高表達(dá)可能通過影響MAPK信號通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移，有可能作為膠質(zhì)瘤的診斷、判斷預(yù)后的分子標(biāo)志物及治療的分子靶點(diǎn)。而Wang等[19]研究證明在U87和U251中過表達(dá)lncRNA-MEG3會抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，同時還會促進(jìn)膠質(zhì)瘤瘤細(xì)胞的凋亡。胡瀧[20]的研究證實(shí)SNHG3與細(xì)胞的脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，SNHG3可能通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子SREBP-lc來調(diào)控肝癌細(xì)胞的脂質(zhì)代謝活動。但是，SNHG3在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平和臨床意義卻鮮有相關(guān)的研究和結(jié)果。

本研究通過分析空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2008年6月- 2013年6月收治的70例腦膠質(zhì)瘤患者的相關(guān)病理資料，采用RT-PCR技術(shù)檢測SNHG3在不同級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)量。結(jié)果表明其在膠質(zhì)瘤組織中SNHG3表達(dá)量明顯高于正常組織，并且與膠質(zhì)瘤的病理級別呈正相關(guān)，這提示我們SNHG3可能是促進(jìn)腫瘤組織發(fā)展的原癌基因。進(jìn)一步通過單因素和多因素分析發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中SNHG3較高水平表達(dá)、高病理級別，KPS評分＜80以及術(shù)后復(fù)發(fā)均為影響預(yù)后的獨(dú)立因素。生存分析顯示，SNHG3高表達(dá)組術(shù)后5年生存率顯著低于SNHG3低表達(dá)組。

綜上，本研究證實(shí)了SNHG3在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平顯著增高，且高表達(dá)水平的SNHG3是造成膠質(zhì)瘤患者不良臨床預(yù)后的重要原因。但是我們尚未探討SNHG3促進(jìn)膠質(zhì)瘤發(fā)展的作用機(jī)制。由于SNHG3在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào)，接下來我們將主要圍繞SNHG3可能促進(jìn)膠質(zhì)瘤發(fā)展的作用機(jī)制展開研究，尋找SNHG3的調(diào)控或參與的信號通路，從而闡明況SNHG3的調(diào)控模式。