基于瑪氏骨條藻轉(zhuǎn)錄組的脂肪酸合成途徑分析?

張 梅， 米鐵柱??， 甄 毓， 王華龍

(1. 中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100； 2. 海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島 266100；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實驗室，山東 青島 266071；4.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003 )

化石燃料的大量燃燒是導(dǎo)致全球變暖的主要原因，生物燃料是可替代化石燃料的可再生能源，脂肪族生物燃料由于其熱值高、性能好而受到廣泛重視。其中，微藻脂肪酸的高生產(chǎn)量使其成為生物燃料研究的熱點之一[1]。近年來隨著微藻脂肪酸生物功能研究的不斷深入，科學(xué)界發(fā)現(xiàn)微藻生產(chǎn)油脂具有其他生物無法替代的優(yōu)點：微藻是光合效率最高的原始植物之一，周期短，生產(chǎn)量大；很多微藻可以在海水中生長，節(jié)省了淡水資源和土地資源；微藻的油脂含量較高，一般可以達(dá)到藻體干重的20%，最高甚至可達(dá)60%[2-3]。盡管產(chǎn)油微藻具有代替化石燃料的潛力[4]，其商業(yè)化應(yīng)用仍存在巨大的經(jīng)濟(jì)挑戰(zhàn)，需要從分子生物學(xué)和基因工程等方面加強(qiáng)對微藻脂肪酸生物合成的研究，以達(dá)到降低生產(chǎn)成本的目的。因此，研究微藻的脂肪酸合成途徑不僅對其生理過程有重要意義，而且還有較為廣泛的應(yīng)用前景。

從生態(tài)學(xué)角度來看，微藻是海洋初級生產(chǎn)力的主要貢獻(xiàn)者，其生產(chǎn)力的高低直接影響著整個海洋生態(tài)系統(tǒng)[5]。從分子水平解釋微藻的生理功能、合成和代謝途徑，對研究微藻的生長、發(fā)育和繁殖具有重要的意義。在實際應(yīng)用方面，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究有助于解釋赤潮發(fā)生、發(fā)展以及消亡的內(nèi)在分子機(jī)制，能夠為赤潮的預(yù)防和治理提供有效的理論依據(jù)。

骨條藻(Skeletonemaspp.)是一類廣溫廣鹽型海洋微型浮游硅藻，有時會引發(fā)赤潮[6]。由于骨條藻種類之間的形態(tài)學(xué)差異非常細(xì)微，鑒定難度大，長期以來一直以中肋骨條藻(S.costatum)作為該屬的模式種和代表進(jìn)行研究，在涉及到骨條藻的生理生化研究中，并未對研究對象進(jìn)行嚴(yán)格的區(qū)分鑒定，一般都被當(dāng)作是中肋骨條藻?，斒瞎菞l藻(S.marinoi)是骨條藻屬5種今生種之一，于2005年由Sarno等人分離確認(rèn)[7]。S.marinoi分布廣泛，在我國的長江口及香港海域均有發(fā)現(xiàn)，其從3月份開始進(jìn)入快速繁殖期，是長江口赤潮高發(fā)區(qū)的優(yōu)勢種。本文以S.marinoi為研究對象，確定了其脂肪酸生物合成途徑中的相關(guān)基因，并在此基礎(chǔ)上分析了S.marinoi的脂肪酸生物合成途徑及其在不同生長時期的基因表達(dá)差異，以期為闡明微藻脂肪酸生物合成的內(nèi)在機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 S. marinoi藻種的培養(yǎng)

瑪氏骨條藻(Skeletonemamarinoi)自青島近海海域分離得到，保存于中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室藻種室，培養(yǎng)基為常規(guī)f/2培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為(20±1)℃，培養(yǎng)過程光暗比控制為12 h/12 h，光照強(qiáng)度為80～100 μmol·m-2·s-1。實驗所用海水取自青島近海，鹽度為33，pH為7.8～8.0。

1.2 測序樣品準(zhǔn)備

將分離得到的S.marinoi在實驗室進(jìn)行培養(yǎng)，基于S.marinoi的生長趨勢，收集指數(shù)期(Exponential Phase, EP)、穩(wěn)定期(Stationary Phase, SP)以及衰亡期(Decline Phase, DP)的藻細(xì)胞。對不同生長時期的S.marinoi分別進(jìn)行離心收集，將離心收集到的藻細(xì)胞快速放入液氮中速凍保存。每個樣品設(shè)置3個平行樣進(jìn)行生物學(xué)重復(fù)，樣品由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行總RNA的提取及Illumina Hiseq2000雙端測序。

1.3數(shù)據(jù)預(yù)處理及從頭拼接

將獲得的核苷酸原始序列(Raw Reads)進(jìn)行可信度分析和質(zhì)量評估，去除核苷酸序列中帶接頭的、低質(zhì)量序列得到有效序列(Clean Reads)。用拼接軟件Trinity[8](版本：r2012-10-05)將有效序列進(jìn)行從頭拼接，得到的轉(zhuǎn)錄本序列信息的儲存方式為FASTA格式，以此形成一個轉(zhuǎn)錄組，作為分析的參考序列。

1.4 功能注釋及代謝途徑分析

功能注釋和代謝途徑分析使用的數(shù)據(jù)庫有7個，分別為Nr、Nt、Pfam、KOG、Swiss-Prot、KEGG以及GO數(shù)據(jù)庫。利用NCBI blast 2.2.28+[9]對拼接形成的轉(zhuǎn)錄本與Nr、Nt、Swiss-Prot以及KOG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，其中，Nr、Nt和Swiss-Pro數(shù)據(jù)庫比對evalue閾值為1e-5，對于每條unigene展示top10比對結(jié)果(如果符合條件)，KOG比對evalue閾值為1e-3。通過HMMER 3.0程序，搜索已建好的蛋白結(jié)構(gòu)域的HMM模型，對Pfam蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。GO功能注釋利用Blast2GO v2.5[10]和自寫腳本來完成。利用KAAS服務(wù)器進(jìn)行KEGG代謝途徑分析，KAAS對轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行逐一注釋，對成功注釋的轉(zhuǎn)錄本分配到相應(yīng)的EC編號和其所參與的代謝途徑[11-12]。最后，將Trinity拼接得到的轉(zhuǎn)錄組作為參考序列(ref)，利用RSEM[13]軟件將每個樣品上的clean reads往ref上做mapping，對bowtie的比對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，得到每個樣品比對到每一個基因上的read count數(shù)目。

2 結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序信息及拼接

通過Illumina Hiseq2000測序平臺進(jìn)行雙端測序，總共獲得60 936 371條原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過測序數(shù)據(jù)過濾后得到的有效序列為58 592 306條，占原始序列的96.15%。利用從頭拼接得到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)為39 058個，非重復(fù)序列基因(unigene)為20 139個，長度范圍為200 ～ 20 000 bp。

2.2 功能注釋及代謝分析

通過與上述Nr、Nt等7個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)注釋成功的unigene個數(shù)為14 693個，占總unigene數(shù)的71.3%。其中，在Nr數(shù)據(jù)庫中注釋的成功率最高，為65.25%，在Nt數(shù)據(jù)庫中的注釋率最低，僅為8.52%。GO 和Pfam數(shù)據(jù)庫注釋的成功率較高，分別為53.28%和51.44%，而Swiss-Prot、KOG和KO數(shù)據(jù)庫注釋的成功率較低，分別為33.46%、20.07%和16.73%。

對拼接得到的所有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行GO注釋，將注釋成功的轉(zhuǎn)錄本按照GO三個大類(生物學(xué)過程、細(xì)胞成分、分子功能)的下一層級進(jìn)行分類，劃分為46個類別，包括核糖體結(jié)構(gòu)組分、大分子生物合成、碳利用等。與KOG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，將注釋成功的轉(zhuǎn)錄本按照功能分成26個子家族，包括RNA加工與修飾、能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化、核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與變化等。對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行KO注釋后，將它們參與的KEGG代謝通路進(jìn)行分類，得到了31個類群，可以匹配到EC編號的轉(zhuǎn)錄本為3 816個，并注釋為225條不同的代謝途徑，包括氮代謝途徑、脂肪酸生物合成途徑以及氨基酸代謝途徑等。

2.3 脂肪酸合成途徑分析

基于S.marinoi轉(zhuǎn)錄組的GO功能注釋和KEGG代謝途徑分析，本文已經(jīng)對S.marinoi的氮代謝途徑[14]、碳固定途徑[15]以及硫代謝途徑(未發(fā)表數(shù)據(jù))進(jìn)行了分析。為了全面構(gòu)建S.marinoi的代謝網(wǎng)絡(luò)，計劃對脂肪酸、氨基酸以及淀粉的生物合成及降解等多個代謝途徑進(jìn)行解析。在本研究中，主要對S.marinoi的脂肪酸生物合成途徑進(jìn)行了解析。

通過分析，發(fā)現(xiàn)了與脂肪酸生物合成途徑相關(guān)的26種酶以及33個編碼基因的轉(zhuǎn)錄本。由于微型海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)和三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)已進(jìn)行了全基因組測序，基因注釋較為完整，且與S.marinoi同屬硅藻，為了分析3 種硅藻脂肪酸合成相關(guān)編碼基因的同源性，利用BLASTx比較之后發(fā)現(xiàn)：S.marinoi與同屬中心綱的假微型海鏈藻的基因序列一致性相對較高，而與羽紋綱的三角褐指藻的序列一致性相對較低(見表1)。

結(jié)合KEGG的比對結(jié)果構(gòu)建了S.marinoi的脂肪酸生物合成途徑，脂肪酸生物合成包括三個方面：脂肪酸的從頭合成(見圖1)、脂肪酸碳鏈的延長以及不飽和脂肪酸的生成。脂肪酸的從頭合成起始于線粒體中乙酰-CoA的生成，其中，糖酵解過程是產(chǎn)生乙酰-CoA的主要方式，β-氧化和氨基酸代謝也產(chǎn)生乙酰-CoA。真核藻類的脂肪酸從頭合成是在葉綠體中進(jìn)行的，由于乙酰-CoA是在線粒體中產(chǎn)生，而線粒體內(nèi)膜不允許乙酰-CoA穿透，乙酰-CoA從線粒體到葉綠體中的輸送需要以檸檬酸為載體來完成。在線粒體中，乙酰-CoA和草酰乙酸在檸檬酸合酶(citrate synthase, CS)的作用下生成檸檬酸，隨后，檸檬酸跨越線粒體內(nèi)膜進(jìn)入到細(xì)胞溶液中與檸檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase, ACL)作用生成乙酰-CoA和草酰乙酸，之后乙酰-CoA進(jìn)入到葉綠體中進(jìn)行脂肪酸的從頭合成。

S.marinoi脂肪酸碳鏈的延長分為兩個階段，分別在葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進(jìn)行。第一階段是發(fā)生在葉綠體中的脂肪酸從頭合成(見圖1)，合成過程中以不斷延長的?；?ACP為底物，直至C16或C18脂肪酸的生成。第二階段是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的脂酰-CoA延長酶催化C18脂肪酸延長并產(chǎn)生更長碳鏈的脂肪酸(見圖2)，該合成過程中以酰基-CoA為底物，以丙二酸單酰-CoA作為碳鏈延伸的供體，其延長機(jī)制與脂肪酸的從頭合成相似。脂酰-CoA延長酶屬于膜綁定的多酶復(fù)合體，由β-酮酰-CoA合酶(beta-ketoacyl-CoA synthase, KCS)、β-酮酰-CoA還原酶(beta-ketoacyl-CoA reductase, KCR)、β-羥酰-CoA脫水酶(beta-hydroxyacyl-CoA dehydratase, HCD)以及烯酰- CoA還原酶(enoyl-CoA reductase, ECR)組成，其相繼催化縮合、還原、脫水、還原反應(yīng)，每一循環(huán)使碳鏈增加2個碳子長度。

S.marinoi單不飽和脂肪酸的合成主要發(fā)生在葉綠體中，其主要形式為葉綠體中的C16:0-ACP或C18:0-ACP在ADD的作用下生成單不飽和脂肪酸C16:1(9)或C18:1(9)。S.marinoi多不飽和脂肪酸的合成是通過原核途徑和真核途徑來配合完成的，原核途徑發(fā)生在葉綠體中，真核途徑發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。真核途徑與原核途徑的主要區(qū)別是真核途徑可以在脂酰-CoA延長酶的作用下使脂?；奶兼溠由臁Ｖ参镏械娜ワ柡兔覆荒苤苯幼饔糜谟坞x脂肪酸，但可作用于甘油脂質(zhì)。甘油-3-磷酸與?；?CoA或?；?ACP經(jīng)過兩次?；磻?yīng)生成甘油脂質(zhì)。合成甘油脂質(zhì)后，脂肪酸仍可進(jìn)一步加工?；谵D(zhuǎn)錄組的信息，推測S.marinoi多不飽和脂肪酸形成的途徑主要有兩種：一是在葉綠體中形成的C18:1-ACP被轉(zhuǎn)移到sn-1或sn-2位形成磷酸酰甘油，其與半乳糖殘基作用生成單或二半乳糖二酰基甘油，進(jìn)一步在Δ12-去飽和酶(delta-12 fatty acid desaturase, Δ12D)的作用下生成亞油酸，亞油酸在Δ15-去飽和酶(delta-15 fatty acid desaturase, Δ15D)的作用下生成α-亞麻酸；二是發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的多不飽和脂肪酸的生成，在葉綠體中生成的C18:0或C18:1(9)游離脂肪酸自由擴(kuò)散到葉綠體外膜上，被長鏈酰基-CoA合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase, LACS)催化為C18:0-CoA或C18:1-CoA，進(jìn)一步被催化形成磷酸脂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的延長酶和去飽和酶可分別催化磷脂酸的脂酰基進(jìn)行碳鏈延伸和去飽和，其合成途徑主要為ω3和ω6途徑。除了脂酰-CoA延長酶外，還有Δ4D、Δ5D、Δ6D、Δ9D、Δ12D以及Δ15D參與多不飽和脂肪酸的真核合成途徑。多不飽和脂肪酸具體的合成途徑如圖3所示。

(酶由長方形標(biāo)出，代謝通路由橢圓標(biāo)出，圖中X6和X7表示循環(huán)次數(shù)。Enzymes or protein are shown in solid boxes and metabolism pathways are shown in cycles. In the Figure, X6 and X7 is the cycle times.)

圖1 基于S.marinoi轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的從頭拼接及注釋結(jié)果構(gòu)建的脂肪酸從頭合成途徑
Fig.1 Denovo fatty acid synthesis pathway reconstructed based on the de novo assembly and annotation ofS.marinoitranscriptome

(酶由長方形標(biāo)出。Enzymes or protein are shown in solid boxes.)

圖2 基于S.marinoi轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的從頭拼接及注釋結(jié)果構(gòu)建的脂肪酸碳鏈延長途徑
Fig.2 Elongation fatty acid synthesis pathway reconstructed based on the de novo assembly and annotation ofS.marinoitranscriptome

2.4 脂肪酸合成途徑中基因差異表達(dá)的分析

差異基因表達(dá)的輸入數(shù)據(jù)為基因表達(dá)水平分析中得到的read count數(shù)據(jù)，采用DESeq對其進(jìn)行分析[16-18]，篩選閾值為padj<0.05[19],該分析方法基于的模型是負(fù)二項分布，第i個基因在第j個樣本中的read count為Kij，則有

以第i個基因的指數(shù)期和穩(wěn)定期的差異表達(dá)計算為例，A為指數(shù)期j個樣本中第i個基因read count的平均值，B為穩(wěn)定期j個樣本中第i個基因read count的平均值。設(shè)定f=Log2(B/A),若f的絕對值大于2則視為差異顯著。正值視為上調(diào)表達(dá)，負(fù)值視為下調(diào)表達(dá)。

通過分析S.marinoi脂肪酸生物合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)：在穩(wěn)定期和衰亡期，該通路中相關(guān)酶基因的表達(dá)量均無顯著差異，而與指數(shù)期相比有著較顯著的差異。在與脂肪酸合成途徑相關(guān)的26種酶對應(yīng)的33個基因中，存在差異表達(dá)的基因有15個。圖4中列出了這些差異表達(dá)基因在以指數(shù)期的表達(dá)水平為基準(zhǔn)的情況下的差異表達(dá)倍數(shù)。

CS和ACL是植物脂肪酸合成途徑中的關(guān)鍵調(diào)控酶。童晉[20]通過基因工程的方法在油菜中過量表達(dá)CS基因發(fā)現(xiàn)該酶表達(dá)量的上升會造成脂肪酸合成量的增加，反義表達(dá)則會造成脂肪酸合成量的降低。ACL催化檸檬酸與輔酶A產(chǎn)生乙酰-CoA和草酰乙酸，這是細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生乙酰-CoA的唯一途徑，除此之外再無其他途徑可補(bǔ)充植物生長發(fā)育所需的乙酰-CoA[21]。在擬南芥中，反義表達(dá)ACL基因發(fā)現(xiàn)造成植物矮化、果莢縮短、葉片變小等現(xiàn)象，同時也造成了植物體內(nèi)脂肪酸合成量的降低[20]。如圖4a,b所示，在S.marinoi脂肪酸合成途徑中，CS的編碼基因在穩(wěn)定期出現(xiàn)了顯著的下調(diào)，而ACL的編碼基因在穩(wěn)定期和衰亡期均出現(xiàn)了顯著的下調(diào)，這表明在S.marinoi生長的指數(shù)期，由這兩種酶參與的代謝活動可能更為旺盛。CS和ACL作為脂肪酸合成代謝調(diào)控途徑中的關(guān)鍵酶，影響著細(xì)胞內(nèi)乙酰-CoA的含量，而乙酰-CoA是脂肪酸合成的主要原料，其含量的變化會直接影響脂肪酸的合成。

(酶由長方形標(biāo)出。Enzymes or protein are shown in solid boxes.)

圖3 基于S.marinoi轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的從頭拼接及注釋結(jié)果構(gòu)建的多不飽和脂肪酸生成途徑
Fig.3 Polyunsaturated fatty acid synthesis pathway reconstructed based on thedenovoassembly and annotation ofS.marinoitranscriptome

ACC嚴(yán)密控制著脂肪酸從頭合成的速度，是脂肪酸合成過程中的關(guān)鍵限速酶[22]。ACC催化生成的一部分丙二酸單酰-CoA存在于質(zhì)體中用于脂肪酸的從頭合成；另一部分存在于細(xì)胞溶膠中用于脂肪酸鏈的延伸及其他次生代謝產(chǎn)物的合成[23]。Roesler等[24]利用基因工程的方法將擬南芥的乙酰-CoA羧化酶基因?qū)氲礁仕{(lán)型油菜中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因油菜第一代種子中ACC的活性提高了1.7～1.9倍，種子含油量提高了5%左右。Roessler[25]和Dunahay[26]等利用克隆的方法將硅藻的ACC基因經(jīng)修飾后轉(zhuǎn)化到硅藻自身中后發(fā)現(xiàn)，硅藻ACC的活性提高了2～3倍，脂質(zhì)的含量小幅度增加。如圖4c所示，ACC的編碼基因在穩(wěn)定期和衰亡期出現(xiàn)顯著上調(diào)，S.marinoi生長進(jìn)入穩(wěn)定期后，細(xì)胞生長緩慢，碳代謝流主要轉(zhuǎn)向脂肪酸的生物合成，細(xì)胞開始進(jìn)行油脂積累。作為脂肪酸合成途徑中的限速酶，ACC編碼基因的上調(diào)表達(dá)促使更多的乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰-CoA而加速脂肪酸生物合成途徑，從而為脂肪酸的合成提供一定的物質(zhì)保證。本文在S.marinoi轉(zhuǎn)錄組中還發(fā)現(xiàn)了生物素羧化酶(Biotin Carboxylase, BC)的編碼基因，BC是ACC組成的亞基單元之一，BC的編碼基因在不同生長時期的差異表達(dá)情況與ACC的編碼基因基本一致，具體如圖4d所示。

MCAT是肪酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，MCAT的活性與脂肪酸含量的高低密切相關(guān)。Cheng等[27]將Schizochytriumsp. TIO1101的MCAT基因在釀酒酵母中過量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其生物量和脂肪酸總量分別提高了16.8%和62%。研究者利用基因技術(shù)在擬南芥、油菜等植物中過量表達(dá)MCAT基因，發(fā)現(xiàn)對C16和C18類脂肪酸的積累有很好的促進(jìn)作用[28-30]。如圖4e所示，MCAT的編碼基因在穩(wěn)定期和衰亡期均出現(xiàn)顯著上調(diào)，間接說明S.marinoi在穩(wěn)定期和衰亡期的脂肪酸合成能力可能要高于指數(shù)期。

脂肪酸從頭合成過程中的另一個關(guān)鍵酶是脂肪酸合成酶(FAS)，它催化脂肪酸碳鏈的延長。植物FAS為原核形式的多酶復(fù)合體(FASII)，由ACP、KAS(KASI, KASII, KASIII)、KAR、HAD、EAR和OAT構(gòu)成[31]。

在FAS中，KASIII是當(dāng)前脂肪酸生物合成積累研究的主要熱點。研究者通過過量表達(dá)KASIII基因來調(diào)控脂肪酸的生物合成，Dehesh等[32]將菠菜的KASIII基因在煙草、擬南芥、油菜中三種植物中超量表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)C16:0脂肪酸的含量增加但脂肪酸合成速率降低。Verwoert等[33]將E.coli的KASIII基因在油菜籽中超量表達(dá)后也得到了類似的結(jié)果：脂肪酸的組成雖然發(fā)生了變化，但脂肪酸的含量沒有提高且細(xì)胞生長嚴(yán)重受阻。上述現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與植物FAS是多酶復(fù)合體有關(guān)，每個亞基的表達(dá)活性與其他亞基相互依存，相互制約[34]。在脂肪酸的生物合成中FAS基因的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，但可以明確的是FAS活性提高，有助于促進(jìn)脂肪酸的生物合成。目前，在國內(nèi)外的研究中鮮有發(fā)現(xiàn)微藻FAS超量表達(dá)的相關(guān)報告。

較指數(shù)期相比，F(xiàn)AS中3種酶的5個編碼基因在穩(wěn)定期和衰亡期均出現(xiàn)顯著上調(diào)，分別為KASI、KASII、KASIII、KAR以及EARI的編碼基因，差異表達(dá)情況具體如圖4f，j所示。S.marinoi在進(jìn)入穩(wěn)定期后，KASI等5個編碼基因的顯著上調(diào)為細(xì)胞的油脂積累提供了有利的物質(zhì)條件，同時，KASI等編碼基因表達(dá)的變化體現(xiàn)了S.marinoi能量固定以及儲能代謝途徑的變化，這與藻類在不同生長階段的分子響應(yīng)有著密切的關(guān)系。

(各柱狀圖橫坐標(biāo)表示不同生長時期：EP，指數(shù)期；SP，穩(wěn)定期；DP，衰亡期?？v坐標(biāo)表示在以指數(shù)期的表達(dá)水平為基準(zhǔn)的情況下的f數(shù)值。In each bar chart, the horizontal ordinate represents different growth stages: EP, exponential phase; SP, stationary phase; DP, decline phase. The numbers of vertucal ordinate are thefvalue as a benchmark of EP.)

圖4S.marinoi脂肪酸生物合成途徑中差異表達(dá)的基因
Fig.4 Different gene expression involving in fatty acid synthesis

在脂肪酸的碳鏈延長途徑中，發(fā)現(xiàn)有3種酶的4個編碼基因的表達(dá)在S.marinoi的不同生長時期表現(xiàn)出顯著差異，其中，HCD、ECR和LACS(Comp17540_c0)的編碼基因在穩(wěn)定期和衰亡期均出現(xiàn)顯著上調(diào)，而LACS(Comp14198_c0)的編碼基因在穩(wěn)定和衰亡期則出現(xiàn)顯著下調(diào)。HCD等3個編碼基因的上調(diào)意味著S.marinoi在進(jìn)入穩(wěn)定期后可能生成了更多的長鏈脂肪酸，以滿足細(xì)胞正常生命活動的需求，而Comp14198_c0編碼基因顯著下調(diào)意味著一部分編碼基因表達(dá)量的降低，可能會造成相關(guān)代謝的減緩。

在脂肪酸的去飽和途徑中，發(fā)現(xiàn)Δ12D的編碼基因在穩(wěn)定期和衰亡期均出現(xiàn)顯著上調(diào)(見圖4o)，Δ12D能夠催化油酸形成亞油酸。Δ12D編碼基因的表達(dá)量的提高有助于亞油酸的生物合成，而亞油酸是多不飽和脂肪酸合成的重要前體物質(zhì)，Δ12D編碼基因的上調(diào)表達(dá)為藻類多不飽和脂肪酸的合成提供了一定的物質(zhì)保證。

通過對S.marinoi脂肪酸生物合成相關(guān)編碼基因在不同生長時期表達(dá)量的分析，初步推測在穩(wěn)定期S.marinoi的脂肪酸的生物合成更為旺盛，造成上述結(jié)果的原因可能與碳代謝流的競爭有關(guān)。在指數(shù)期，培養(yǎng)基中N、P等營養(yǎng)元素較為充足，在營養(yǎng)鹽充足的情況下，微藻細(xì)胞生長繁殖快速，致使主要的碳代謝流向了細(xì)胞生長；而當(dāng)微藻的生長進(jìn)入穩(wěn)定期后，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)元素逐漸被耗盡，使微藻的生長處于營養(yǎng)限制的條件下，致使細(xì)胞的生長繁殖變緩，促使主要的碳代謝流轉(zhuǎn)向細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的積累，例如，部分碳代謝流以乙酰-CoA的形式轉(zhuǎn)向脂肪酸的生物合成。在S.marinoi的脂肪酸生物合成途徑中，發(fā)現(xiàn)以ACC編碼基因為代表的12個編碼基因在穩(wěn)定期和衰亡期均出現(xiàn)了顯著上調(diào)，而CS、ACL和LACS(Comp14198_c0)的編碼基因在不同生長時期出現(xiàn)了顯著下調(diào)。在后續(xù)的研究中，將著重加強(qiáng)對這15個編碼基因的研究，計劃利用熒光定量檢測的方法來驗證轉(zhuǎn)錄組的測序結(jié)果，從而分析S.marinoi的脂肪酸生物合成在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控途徑。通過監(jiān)測S.marinoi脂肪酸生物合成途徑中相關(guān)酶的基因表達(dá)情況，有助于闡述脂肪酸生物合成的內(nèi)在分子機(jī)制，為微藻的脂肪酸生物合成機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，S.marinoi是中國海域的廣布種，同時，也是一種常見的赤潮引發(fā)種。在對赤潮的研究中，可以將S.marinoi作為典型，對其的生理生化機(jī)理進(jìn)行研究，從而闡明該藻引發(fā)赤潮的發(fā)生、發(fā)展以及消亡的內(nèi)在分子機(jī)制，為赤潮的預(yù)警和有效防治提供一定的理論基礎(chǔ)。利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對S.marinoi的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行構(gòu)建，不但有助于從分子水平了解微藻的生理代謝機(jī)制，而且對赤潮的預(yù)警和防治提供了新的思路。

3 結(jié)語

本研究中對不同生長時期的S.marinoi進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，通過分析發(fā)現(xiàn)存在26個與脂肪酸合成相關(guān)的酶及33個對應(yīng)的編碼基因，經(jīng)過序列對比分析發(fā)現(xiàn)，這些編碼基因與假微型海鏈藻有較高的序列一致性，而與三角褐指藻的序列一致性較低。通過比較S.marinoi不同生長時期的轉(zhuǎn)錄組以及KEGG差異的分析結(jié)果，確定了脂肪酸合成途徑中基因的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在該代謝通路中存在顯著差異表達(dá)的基因有15個。與指數(shù)期相比， ACL和LACS(Comp14198_c0)的編碼基因在穩(wěn)定期和衰亡期出現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)，而CS的編碼基因僅在穩(wěn)定期出現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)。與之相反的是，以ACC編碼基因為代表的12個編碼基因在穩(wěn)定期和衰亡期均出現(xiàn)了顯著上調(diào)?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，可以初步推測出S.marinoi在穩(wěn)定期的脂肪酸合成能力高于指數(shù)期。這些信息為海洋微藻脂肪酸生物合成途徑的研究提供了理論基礎(chǔ)，有助于對S.marinoi進(jìn)行基因改造，提高脂肪酸的合成量。同時，又能為赤潮的防治提供新的思路。

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