于佳辰， 張玲玲,2??， 李仰平， 李若佼， 李婉茹， 孫文倩， 包振民,2

(1．中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266003；2．海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266071)

SOX(SRY-related HMG-box)基因家族是一類SRY(Sex determination region of Y chromosome)相關(guān)基因構(gòu)成的基因超家族。首個(gè)發(fā)現(xiàn)的SOX基因家族成員是SRY[1]基因，位于哺乳動(dòng)物的Y染色體上，它含有一個(gè)編碼79個(gè)氨基酸并能與DNA特異性識(shí)別和結(jié)合的高度保守區(qū)域——HMG(High mobility group)盒。所有的SOX基因家族成員都含有這個(gè)HMG盒，并且與SRY的HMG盒有至少50%的同源性[2]。目前，根據(jù)Bowles等提出的以HMG盒的相似性定義SOX基因的標(biāo)準(zhǔn)，將SOX基因分為A-K 11個(gè)亞族[2-4]。SOX基因家族是一類核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與了動(dòng)物的早期胚胎發(fā)育過程，包括神經(jīng)發(fā)育[5-8]、骨組織發(fā)育[9]、性別決定和分化[10-12]等。

從以往來(lái)看，性別決定和分化一直都是SOX基因研究的經(jīng)典領(lǐng)域，相關(guān)的SOX基因有SOX6、SOX9和SOXH等。其中SOXH是SOX基因家族H亞族的唯一成員，在某些物種中也稱SOX30。在人和小鼠中，SOX30特異性表達(dá)中于睪丸的生殖細(xì)胞中，被認(rèn)為可能在精原細(xì)胞的分化和精子的形成過程中起關(guān)鍵作用[13-14]。SOXH曾一度被認(rèn)為是高等脊椎動(dòng)物所特有，直到2010年Han等[15]在羅非魚(Oreochromisniloticus)中將SOX30克隆出來(lái)，相繼Zhang等[12]又在牡蠣(Crassostreagigas)中鑒定出Cg-SOX30。但關(guān)于無(wú)脊椎動(dòng)物SOXH的功能，目前還缺乏深入的研究。

蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)原產(chǎn)于日本北海道北部和俄羅斯千島群島的南部，1982年從日本引進(jìn)中國(guó)以來(lái)，經(jīng)多年的養(yǎng)殖推廣，近 10 年來(lái)創(chuàng)造了數(shù)十億元的產(chǎn)值，已成為中國(guó)北方最重要的海水養(yǎng)殖貝類之一[16]。大量與蝦夷扇貝免疫、繁殖、生長(zhǎng)等重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的功能基因被克隆[17-19]，多個(gè)蝦夷扇貝的轉(zhuǎn)錄組被報(bào)道[20-22]。近期，蝦夷扇貝基因組序列圖譜完成，更是為貝類功能基因的研究提供了新的契機(jī)。本研究將以蝦夷扇貝基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，研究SOXH不同剪接形式在成體性腺及胚胎幼蟲發(fā)育中的表達(dá)情況，為深入解析無(wú)脊椎動(dòng)物SOXH的功能提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 材料獲取和保存

實(shí)驗(yàn)樣本采自大連市獐子島漁業(yè)集團(tuán)有限公司，通過為期一年的跟蹤取材，獲得了蝦夷扇貝休止期、增殖期、生長(zhǎng)期和成熟期的性腺組織材料，每個(gè)時(shí)期各取2份樣品。一份通過液氮固定后裝于凍存管中，在-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?；另一份?jīng)4%的多聚甲醛固定后，置于甲醇中-20℃長(zhǎng)期保存。胚胎材料取自蝦夷扇貝育苗期間，通過人工促熟產(chǎn)卵、受精和幼蟲養(yǎng)殖的方式獲得了卵、受精卵、多細(xì)胞期、囊胚期、原腸胚期、擔(dān)輪幼蟲、D型幼蟲、匍匐幼蟲的實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 SOXH基因及不同剪接形式的鑒定

從NCBI下載人、小鼠、爪蟾和果蠅的SOX蛋白序列，通過SMART分析獲得這些基因的HMG結(jié)構(gòu)域。將人的SOXH的HMG蛋白序列通過TBLASTN與蝦夷扇貝的基因組進(jìn)行比對(duì)，e值設(shè)定為1e-10，篩查蝦夷扇貝SOXH候選基因；

通過MEGA7.0軟件，對(duì)不同物種SOX蛋白的HMG結(jié)構(gòu)域構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，確定蝦夷扇貝SOXH基因。系統(tǒng)發(fā)生樹采用NJ(Neighbor-Joining)法構(gòu)建，Bootstrap值設(shè)定為1 000；

將鑒定得到的SOXH基因序列與蝦夷扇貝性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)[22]進(jìn)行BLASTN比對(duì)，e值設(shè)定為1e-10，鑒定SOXH的不同剪接形式。

1.3 性腺的組織學(xué)鑒定

利用常規(guī)的石蠟切片方法對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的性腺組織進(jìn)行固定、脫水、透明、浸蠟和包埋、切片和染色。然后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，通過濾泡和生殖細(xì)胞的形態(tài)特征鑒定性腺的性別及所處發(fā)育時(shí)期。

1.4 總RNA提取和cDNA合成

采用傳統(tǒng)的酚氯仿抽提方法，對(duì)鑒定的休止期、增殖期、生長(zhǎng)期和成熟期雌雄性腺以及胚胎幼蟲材料進(jìn)行RNA提取。通過Nanovue Plus分光光度計(jì)進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定，電泳檢測(cè)總RNA完整性。隨即用MMLV(Moloney murine leukemia virus)反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行第一鏈cDNA的合成，最終每個(gè)樣品稀釋到50 Mg/mL，用于qRT-PCR分析。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR

利用Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，獲得各剪接形式特異性的引物(見表1)。用于胚胎幼蟲時(shí)期和性腺組織熒光定量PCR分析的內(nèi)參基因分別為cytochrome B (CB)[23]和elongation factor 1-alpha (EF1A)[22]，所有引物由上海生工合成。通過對(duì)5個(gè)系列梯度稀釋樣品進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得引物的擴(kuò)增效率。儀器和試劑分別采用羅氏公司的480熒光定量PCR儀和Fast Start Universal SYBR Green Master。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃/10 min；94 ℃/15 s，58 ℃/1 min，72 ℃/30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，溫度由94～55 ℃緩慢降低，連續(xù)采集熒光信號(hào)并獲取熔解曲線，根據(jù)峰值是否單一判斷引物的特異性。生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)各3次，相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCt方法，數(shù)據(jù)在SPSS軟件(版本21.0)上進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，顯著性P值<0.05。成熟期精巢中SOXH不同剪接形式的表達(dá)偏好性通過如下方法計(jì)算獲得：在每個(gè)精巢樣品中，將SOXH1、SOXH2和SOXH3的表達(dá)量求和，分別將各個(gè)剪接形式的表達(dá)量與總和求比值，獲得各個(gè)剪接形式表達(dá)量的相對(duì)百分比。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物Table 1 Primers for quantitative real-time PCR

2 結(jié)果

2.1 蝦夷扇貝SOXH基因不同剪接形式鑒定

基于蝦夷扇貝基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息，將人SOXH基因的HMG序列為探針，在本地服務(wù)器與蝦夷扇貝基因組進(jìn)行同源性比對(duì)，篩選得到SOXH候選基因，通過系統(tǒng)發(fā)生分析(見圖1)，發(fā)現(xiàn)其與人和小鼠的SOX30聚在一支，支持度達(dá)到99，驗(yàn)證該候選基因即為蝦夷扇貝的SOXH。

(通過SMART在線結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)軟件提取SOX基因的HMG序列，在MEGA7.0中采用NJ方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，物種包括人(Homosapiens)，小鼠(Musmusculus)，果蠅(Drosophilamelanogaster)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)和蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis). HMG domain was predicted by the SMART online domain-predicting program. The tree was built by the neighbor-joining (NJ) method provided by MEGA 7.0. Species include human (Homosapiens), mouse (Musmusculus), fruit fly (Drosophilamelanogaster), African clawed frog (Xenopuslaevis) and Yesso scallop (Patinopectenyessoensis).)

圖1 蝦夷扇貝SOXH系統(tǒng)發(fā)生分析圖
Fig.1 Phylogenetic tree of thePatinopectenyessoensisSOXH

將已鑒定的SOXH與性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對(duì)，最終鑒定出SOXH有3種剪接形式，分別是SOXH1、SOXH2和SOXH3。如表2所示，SOXH3的cDNA的片段最長(zhǎng)，編碼氨基酸數(shù)目最多，有7個(gè)外顯子，次之是SOXH2和SOXH1。詳細(xì)的剪接方式見圖2。3種剪接方式都具有完整的HMG盒，剪接方式的差異部分從第5個(gè)外顯子開始。與基因組序列相比，SOXH1的E6、E7和E8三個(gè)外顯子被剪接掉，位于E5的3’UTR區(qū)在三者之中最短；SOXH2的E5外顯子的末端部分被剪接掉，它的3’UTR區(qū)最長(zhǎng)，從E6的前半部分開始直到序列尾部；SOXH3的被剪接部分既有與SOXH2相同的E5末端，還有整個(gè)E6，3’UTR區(qū)長(zhǎng)度居于三者之間，在E8的尾部。

表2 蝦夷扇貝SOXH三種剪接形式的基本信息Table 2 Basic information of the three splicing patterns of scallop SOXH

(矩形表示外顯子(E)，實(shí)線或虛線表示內(nèi)含子(I)，黑色部分表示HMG盒，陰影部分表示UTR區(qū)，外顯子上下方的短實(shí)線表示引物位置，其中SOXH2和SOXH3的正向引物跨越外顯子邊界。Rectangle indicates exon (E), solid or dotted lines indicate intron (I), black region indicates HMG-box, shadow region indicates UTR,short lines above or under the exon indicate the position of primers. Note forward primers ofSOXH2 andSOXH3 locate at exon-exon junction.)

圖2SOXH三種剪接形式示意圖
Fig.2 Schematic diagram of three splicing patterns ofSOXH

2.2 SOXH三種剪接形式在性腺中的表達(dá)模式

為了研究不同剪接形式在扇貝性腺發(fā)育中的功能，本研究檢測(cè)了休止期、增殖期、生長(zhǎng)期和成熟期精巢和卵巢中SOXH1、SOXH2和SOXH3的表達(dá)模式，結(jié)果見圖3。SOXH的3種剪接形式在性腺中的表達(dá)模式相似，即在精巢成熟期高表達(dá)，其他3個(gè)時(shí)期表達(dá)量較低；而在卵巢中，4個(gè)發(fā)育時(shí)期表達(dá)量均較低。

(紅色表示卵巢，藍(lán)色表示精巢。顯著性差異： *P< 0.05， **P< 0.01，***P< 0.001。Red bars represent ovary, blue bars represent testis. Significant difference: *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001.)

圖3SOXH三種剪接形式在不同發(fā)育時(shí)期的精巢和卵巢的表達(dá)模式圖
Fig.3 Expression profiles of the three splicing patterns ofSOXHin testes and ovaries of different developmental stages

為進(jìn)一步分析成熟期精巢中SOXH1、SOXH2和SOXH3表達(dá)是否存在偏好性，本研究選取10個(gè)成熟期精巢樣品，進(jìn)行表達(dá)模式的偏好性分析，結(jié)果如圖4所示。在檢測(cè)的10個(gè)精巢組織中，SOXH3的表達(dá)量一致較高，占三者表達(dá)總量的60%以上，其中有8個(gè)精巢組織在90%以上；而SOXH2和SOXH1的表達(dá)量普遍較低，各有一個(gè)精巢組織的表達(dá)量相對(duì)百分比在30%以上。

(藍(lán)色代表SOXH1，紅色代表SOXH2，綠色代表SOXH3。 Blue, red and green bars representSOXH1,SOXH2 andSOXH3, respectively.)

圖4SOXH的3種剪接形式在10個(gè)成熟期精巢的相對(duì)表達(dá)量示意圖
Fig.4 Relative expression of the three splicing patterns ofSOXHin ten mature testes

2.3 SOXH三種剪接形式的胚胎幼蟲表達(dá)分析

選取蝦夷扇貝從卵到匍匐幼蟲共11個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期，分析SOXH的3種剪接形式的表達(dá)情況。如圖5所示，在早期發(fā)育過程中，SOXH1、SOXH2和SOXH3呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。SOXH1的表達(dá)出現(xiàn)在卵、受精卵，以及擔(dān)輪幼蟲之后的各個(gè)時(shí)期，在殼頂中期表達(dá)水平最高；從卵發(fā)育到殼頂幼蟲后期，SOXH2基本不表達(dá)，僅在匍匐幼蟲期有明顯的上調(diào)表達(dá)；SOXH3的表達(dá)有兩個(gè)明顯的峰值，分別出現(xiàn)在原腸期和殼頂幼蟲后期-匍匐幼蟲。在多細(xì)胞期和囊胚期，三種剪接形式的表達(dá)量都很低。

3 討論

前體mRNA的選擇性剪接越來(lái)越多的被認(rèn)為是調(diào)控基因表達(dá)的重要機(jī)制，以往的研究表明，人體內(nèi)超過半數(shù)以上的基因都能進(jìn)行選擇性剪接，作用范圍涉及到多種生理發(fā)育過程和疾病發(fā)生等[24]。一段前體mRNA通過不同的剪接方式可以形成多種mRNA，進(jìn)而翻譯出不同的蛋白產(chǎn)物，執(zhí)行不同的生物學(xué)功能。

關(guān)于SOX基因具有不同剪接形式的報(bào)道并不鮮見，Kanai等在小鼠的精巢中發(fā)現(xiàn)了SOX17的兩種剪接形式，分別是SOX17和t-SOX17，隨著小鼠的精子發(fā)生，兩種亞型之間的轉(zhuǎn)換暗示了它們可能具有不同調(diào)控機(jī)制[25]；而Takase等在粗皮蛙的精巢中鑒定出SOX9α和SOX9β，兩種亞型在成體蛙不同組織中的表達(dá)量存在差異，尤其是在腦和精巢中[26]。

(藍(lán)色代表SOXH1，紅色代表SOXH2，綠色代表SOXH3 Blue line indicatesSOXH1, red line indicatesSOXH2, green line indicatesSOXH3.卵：Docytes;受精卵：Fertilized eggs；多細(xì)胞：Morulae;囊胚期：Blastulae;原腸期：Gastrulae;擔(dān)輪幼蟲：Trochophores;D形幼蟲：D-shaped larvae;殼頂前期：Early umboperiod.殼頂中期：middle umbo period;殼頂后期：Find umbo period;匍匐幼蟲：Creeping larvae.)

圖5SOXH三種剪接形式在早期胚胎幼蟲發(fā)育階段的表達(dá)情況
Fig.5 Expression profiles of the three splicing patterns ofSOXHin early developmental stages

關(guān)于SOXH不同剪接方式的研究，韓飛等[27]在羅非魚中鑒定出4種亞型的mRNA，分別是、Ⅲ和Ⅵ。除AS-Ⅰ和Ⅱ外，其他兩種亞型的的HMG結(jié)構(gòu)域都有缺失，并且它們?cè)诰埠吐殉仓斜磉_(dá)模式也有很大差異。本研究在蝦夷扇貝中共鑒定出3種SOXH的剪接亞型，發(fā)生剪接的部分都在HMG結(jié)構(gòu)域之外，位于mRNA的3’端，從第五個(gè)外顯子開始，通過切除或缺失部分外顯子形成。SOXH1由可選擇的終止外顯子剪接方式獲得，3’端的E6、E7和E8全部被剪切，終止密碼子在E5上；SOXH2由可選擇5’位點(diǎn)剪接方式獲得，部分E5被剪切，導(dǎo)致移碼突變，終止密碼子后移至E6上；而SOXH3則是通過可選擇5’位點(diǎn)和外顯子跳躍的兩種復(fù)合剪接方式獲得，丟失部分E5和整個(gè)E6，同樣導(dǎo)致移碼突變，將終止密碼子后移至E8，并獲得最長(zhǎng)的翻譯區(qū)。

蝦夷扇貝SOXH的3種剪接亞型都高表達(dá)于精巢，而在卵巢中的表達(dá)量均較低，這種表達(dá)模式與羅非魚SOXH部分亞型的表達(dá)模式相似。比如羅非魚SOXH的AS-Ⅱ和AS-Ⅲ都只在精巢中特異性表達(dá)。與羅非魚不同的是，蝦夷扇貝中沒有檢測(cè)到在卵巢中表達(dá)水平高于精巢的亞型，而在羅非魚中，AS-Ⅵ亞型在卵巢的表達(dá)水平則高于精巢。出現(xiàn)這種差異表達(dá)模式的原因可能與2個(gè)物種SOXH剪接方式的不同有關(guān)：羅非魚AS-Ⅵ亞型的HMG結(jié)構(gòu)域全部被剪切，而蝦夷扇貝SOXH3種亞型的剪切部分并不涉及HMG結(jié)構(gòu)域。

雖然蝦夷扇貝SOXH的3種剪接亞型在成體性腺中的表達(dá)模式較為一致，但是細(xì)究它們?cè)诰渤墒炱诘谋磉_(dá)方式，還是存在主次之分，SOXH3是主要的剪接亞型。從三者的基因結(jié)構(gòu)來(lái)看，SOXH3編碼的氨基酸數(shù)目最多，而SOXH1和SOXH2則提前終止，這對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能可能造成一定的影響，這是否與蝦夷扇貝對(duì)三種亞型的偏好有關(guān)，有待進(jìn)一步探究。另外，三種亞型在胚胎幼蟲早期發(fā)育中的表達(dá)模式有明顯差異，暗示了它們可能在不同發(fā)育時(shí)期執(zhí)行不同的功能，其中SOXH1在大部分時(shí)期居高，可能在胚胎幼蟲發(fā)育中有著重要的作用。上述研究表明蝦夷扇貝SOXH的3種剪接形式可能不同程度地參與早期發(fā)育和精子發(fā)生過程，其具體的功能以及分子機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

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