曬干處理對花生過敏原蛋白潛在致敏性的影響

常雪嬌，李 坤，張 英，陳紅兵，吳志華,*

花生是我國主要的油料作物、經(jīng)濟(jì)作物，也是我國的優(yōu)勢出口農(nóng)作物，我國花生現(xiàn)種植面積約占世界總種植面積的20%；年產(chǎn)量約有1 500萬 t，占世界總產(chǎn)量的40%，居世界首位[1]?；ㄉ谑称沸袠I(yè)中有廣泛的應(yīng)用，但是花生同時(shí)也是八大過敏性食物之一[2]，其致敏性也得到了廣泛的關(guān)注[3-4]，2010年，在加拿大的一個(gè)全國性調(diào)查中，花生過敏癥的患病率為0.61%[5]。法國的一項(xiàng)調(diào)查結(jié)果顯示，花生過敏患者占食物過敏患者總?cè)藬?shù)的28%[6]。據(jù)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)變態(tài)反應(yīng)科調(diào)查，北京地區(qū)約有4%的食物過敏患者對花生過敏[7]。花生過敏會產(chǎn)生嚴(yán)重的變態(tài)反應(yīng)，而且通常是終身的，只有10%左右的過敏兒童會隨年齡增長產(chǎn)生耐受性[8]。截止2016年，國際免疫學(xué)會聯(lián)合會已經(jīng)確認(rèn)了Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3/4等17 種花生中的過敏原蛋白[9-11]。其中Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3/4、Ara h 6屬于主要過敏原，可被高達(dá)90%的花生過敏患者識別[12]。

花生富含蛋白質(zhì)和油脂，在高水分和新陳代謝較強(qiáng)的情況下，很容易變質(zhì)，由于花生種子后熟期較長，酶活性很強(qiáng)，呼吸過程中放出較多的水汽和熱量，導(dǎo)致花生在種植、收獲、貯藏、生產(chǎn)各個(gè)過程中極易受不同生物的侵染。在我國，花生受黃曲霉菌及其毒素的污染尤為嚴(yán)重[13-14]。黃曲霉毒素是由黃曲霉等真菌產(chǎn)生的一類具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，是強(qiáng)致癌物，對人類及牲畜健康危害極大，黃曲霉毒素污染嚴(yán)重威脅著花生相關(guān)食品產(chǎn)業(yè)的安全，甚至影響了我國花生產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[15]。干燥作為花生產(chǎn)品加工的重要環(huán)節(jié)之一，是保證花生品質(zhì)，防止其霉變的必要手段?；ㄉ稍锏姆椒ㄒ话阌凶匀粫窀煞ê蜋C(jī)械烘干法。

干燥過程中，花生會發(fā)生一系列的生理生化過程，影響過敏原蛋白的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。已有報(bào)道顯示，機(jī)械烘干過程中，花生隨著水分的減少，不僅會發(fā)生顏色的變化，花生中可溶性蛋白和糖的含量也會減少[16]。在高溫烘烤過程中，花生過敏原蛋白的結(jié)構(gòu)會變得松散，致敏性增強(qiáng)[17]。農(nóng)戶食用花生則以曬干為主，即直接將收獲的花生莢果攤開晾曬，利用太陽照射和空氣流動(dòng)減少莢果中的水分，直至花生莢果含水量達(dá)到安全貯藏標(biāo)準(zhǔn)[18-19]，曬干后花生中過敏原蛋白含量和組成的變化鮮見報(bào)道。

本研究分別從新鮮和曬干處理后的花生籽仁中分離提取花生蛋白，分析花生中的主要過敏原蛋白的數(shù)量、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，探索曬干處理對花生主要過敏原蛋白潛在致敏性的影響，以期為低致敏花生制品的生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮花生購自江西省南昌市青山湖市場。

實(shí)驗(yàn)所用人血清購自重慶曼紐艾克科技有限公司，利用來源于10 名花生過敏患者的血清構(gòu)建了血清池，其特異性免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E水平約為70 IU/mL。

β-巰基乙醇 上海生工生物有限公司；R250、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 天津大茂試劑公司；預(yù)染蛋白Marker 德國Fermentas公司；二喹啉甲酸（bimcincheninic acid，BCA）蛋白質(zhì)定量試劑盒 北京天根生化科技有限公司；96孔酶標(biāo)板美國Corning公司；標(biāo)記羊抗人IgG二抗、鄰苯二胺 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10型pH計(jì) 德國Sartorius公司；FDV型超細(xì)粉碎機(jī) 北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司；RH basic 2 S25型磁力攪拌器 德國IKA公司；Allegra 64R高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；BR680型酶標(biāo)儀、PowerPac3000迷你蛋白電泳儀 美國Bio-Rad公司；SQ-GS800掃描儀 北京宇艾奇科技有限公司；J-810型圓二色光譜（circular dichroism，CD）儀 日本JASCO公司；UV WinLab V6紫外-可見分光光度儀 美國Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 花生曬干處理

選擇成熟度相同、無明顯病蟲害和外觀損傷的新鮮帶殼花生，分別進(jìn)行去殼曬干和帶殼曬干處理。選擇白天平均溫度為35.0 ℃，平均相對濕度為63.6%的晴朗天氣，參照一般國內(nèi)花生曬干的方法[19]將花生攤成薄層，在開闊通風(fēng)的地方暴曬，夜間收回?cái)倹?，連續(xù)5 d，花生失水減少質(zhì)量約37%。

1.3.2 花生樣品脫脂

參照周寧菱[20]的方法進(jìn)行，將沉淀與上清液的分離方法由離心改為抽濾，具體操作如下：將不處理的新鮮花生和進(jìn)行不同曬干處理的花生分別剝殼去種皮，采用超細(xì)粉碎機(jī)在液氮作用下將其粉碎成約100 目的細(xì)粉。將花生粉末利用丙酮脫脂（1∶5，m/V；含體積分?jǐn)?shù)為0.07%的β-巰基乙醇），于4 ℃條件下磁力攪拌脫脂2 h，再利用抽濾裝置在通風(fēng)櫥中抽干，棄濾液，重復(fù)脫脂2 次，最后將沉淀置于通風(fēng)櫥中自然風(fēng)干得花生脫脂粉，-20 ℃下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 花生樣品中蛋白質(zhì)的定量與定性

1.3.3.1 花生樣品中粗蛋白含量測定

參照GB/T 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》[21]，采用凱氏定氮法測定不同花生樣品脫脂粉中粗蛋白含量，將脫脂粉0.1 g、硫酸銅0.5 g、硫酸鉀3.0 g和硫酸一起加熱，進(jìn)行消化，并用0.1 mol/mL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液滴定。每個(gè)樣品做3 次平行，花生的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化系數(shù)為5.46[21-22]，將結(jié)果折算成新鮮花生中粗蛋白的含量。

1.3.3.2 花生蛋白的提取

參照周寧菱[20]的方法進(jìn)行。將花生脫脂粉0.8 g與50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.2）按1∶5（m/V）比例混合，于4 ℃條件下磁力攪拌提取10 h。提取結(jié)束后，于4 ℃、9 000 r/min離心15 min，所得上清液即為第1次提取液，將沉淀按照以上步驟重復(fù)浸提2 次，獲得第2次和第3次的蛋白提取液，均凍存于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.3 BCA法測定花生提取液中蛋白質(zhì)量濃度

參照BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒的說明書，測定花生樣品脫脂粉經(jīng)3 次提取后所得提取液中蛋白質(zhì)量濃度，選用標(biāo)準(zhǔn)溶液為2 000 μg/mL BSA溶液，配制一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度梯度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，工作液顯色，在562 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

花生樣品蛋白提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使質(zhì)量濃度落于標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。計(jì)算出花生樣品蛋白提取液中花生蛋白的質(zhì)量濃度，計(jì)算脫脂粉中可提取蛋白質(zhì)量濃度，可提取蛋白質(zhì)量濃度在總蛋白中所占比值即為蛋白質(zhì)的提取率。

1.3.3.4 SDS-PAGE定性分析

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）法分析不同蛋白提取液中蛋白組分的變化?；ㄉ鷺悠返鞍滋崛∫褐谢ㄉ鞍踪|(zhì)量濃度為1 mg/mL，上樣量為10 μL。Marker上樣量為4 μL，選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%分離膠、4%濃縮膠。設(shè)定電泳條件分別為恒流12 mA和24 mA，時(shí)間分別為30 min和1.5 h。電泳結(jié)束后，進(jìn)行剝膠、染色、脫色等工序。采用SQ-GS800光密度掃描儀，對蛋白電泳凝膠進(jìn)行圖象采集并進(jìn)行定性和定量分析。灰度掃描結(jié)果為該條帶占該泳道總灰度的百分比，用此百分比和可提取蛋白的含量計(jì)算得出花生中該過敏原蛋白的質(zhì)量濃度。

1.3.4 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析

1.3.4.1 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

為表征蛋白的二級結(jié)構(gòu)變化，參照李坤等[23]的方法，分別對3 種不同處理的蛋白樣品進(jìn)行色譜檢測，掃描波長范圍為150～250 nm。將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到CD分析網(wǎng)站（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.stml）中進(jìn)行分析，得到各樣品蛋白二級結(jié)構(gòu)成分的含量，獲知不同處理前后α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的含量變化。

1.3.4.2 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析

將不同處理的花生蛋白樣品用紫外-可見分光光度儀進(jìn)行紫外檢測，掃描波長范圍為250～350 nm，光譜間隔1 nm。

1.3.5 花生過敏原蛋白潛在致敏性分析

參照Meng Xuanyi等[24]的方法采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測不同曬干處理后花生過敏原蛋白與IgE的結(jié)合能力，并做如下改動(dòng)：包被蛋白質(zhì)量濃度10 mg/mL，人血清稀釋倍數(shù)為1∶80，二抗稀釋倍數(shù)1∶5 000，親和素稀釋倍數(shù)為1∶100。按下式計(jì)算IgE抑制率。

式中：B為不同曬干處理后競爭蛋白的OD值；B0為無競爭蛋白時(shí)的OD值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每次實(shí)驗(yàn)做3 次平行，數(shù)據(jù)分析采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件，數(shù)據(jù)作圖采用Origin軟件。統(tǒng)計(jì)顯著性分析用單因素方差分析，以P＜0.05表明具有顯著性差異，以P＜0.01表明具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同曬干處理對花生樣品中粗蛋白含量及可提取性蛋白含量的影響

圖1 曬干處理對新鮮花生中粗蛋白以及可提取性蛋白含量的影響Fig. 1 Effect of sun-drying on the contents of crude protein and extractable protein in fresh peanut

由圖1可知，去殼曬干處理后花生中粗蛋白含量約為17.94 g/100 g，帶殼曬干處理后花生中粗蛋白含量約為15.43 g/100 g，可知新鮮花生經(jīng)過去殼曬干處理后，粗蛋白含量略有下降，但與去殼曬干相比沒有顯著性差異，而新鮮花生經(jīng)帶殼曬干處理后，其中粗蛋白含量有極顯著性下降（P＜0.01），去殼曬干的花生中粗蛋白含量多于帶殼曬干的花生。其原因?yàn)椋谙嗤瑮l件曬干時(shí)，進(jìn)行去殼曬干處理的花生干燥失水的速度更快，后熟期更短，影響到植物體內(nèi)細(xì)胞和酶的作用，使其代謝所消耗的蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)更少，粗蛋白的含量相對帶殼曬干花生更高[25]。這一結(jié)論與關(guān)于豆科牧草的相關(guān)研究結(jié)果[26-28]一致，機(jī)械加工聯(lián)合干燥處理可以加快脫水，減少營養(yǎng)成分的消耗和損失，所以進(jìn)行去殼曬干處理的花生中粗蛋白含量多于帶殼曬干的花生。

由圖1可以看出，新鮮花生中可提取性蛋白的量最多，曬干處理后的花生中可提取性蛋白的量有減少但變化不大。雖然提取前、后蛋白質(zhì)含量的檢測方法不同，但凱氏定氮法與BCA法均能準(zhǔn)確測定蛋白質(zhì)含量，兩者的結(jié)果是可比的[29-30]。分析蛋白質(zhì)變化的原因，可能是帶殼曬干花生在后熟期內(nèi)主要消耗轉(zhuǎn)移的是非可溶性蛋白。通過計(jì)算，求得曬干花生中可溶性蛋白質(zhì)占總蛋白的百分比增加，其中以帶殼曬干的最高，由于可溶性蛋白質(zhì)本身能體現(xiàn)代謝的活躍程度[31]，由此可知，帶殼曬干的花生在后熟期內(nèi)代謝活動(dòng)更劇烈。

另外，花生蛋白的提取次數(shù)對花生蛋白含量的影響研究中發(fā)現(xiàn)[32]，在3 次浸提后，大部分蛋白質(zhì)能被提取出來，再繼續(xù)浸提，不僅浪費(fèi)試劑，而且所用的Tris-HCl提取液有可能造成蛋白質(zhì)的水解變性[33]，綜合來說浸提次數(shù)為3 次效果最好。綜合3 次提取的結(jié)果，可以看出花生中蛋白質(zhì)的提取率均達(dá)到了50%，而利用其他方法分離花生蛋白的提取率可高達(dá)70%[34]，這是由于研究中為保證花生中的過敏原蛋白不受破壞，采用了較為溫和的Tris-HCl作為浸提液。

2.2 花生提取液中過敏原的組成

圖2 不同曬干處理后花生蛋白SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE patterns of peanut proteins extracted after different drying treatments

由圖2可知，主要過敏原為Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3/4、Ara h 6。由圖3可知，曬干處理前、后，主要過敏原的含量均發(fā)生了變化。其中過敏原Ara h 1含量在曬干處理后極顯著升高，且?guī)窀珊筮^敏原Ara h 1的含量有顯著性優(yōu)勢；過敏原Ara h 2、Ara h 3/4在曬干處理后極顯著增加，但不同曬干處理方法之間沒有顯著性差異；過敏原Ara h 6在花生中含量很少，不同處理之間含量雖有變化，但沒有顯著性差異?？梢钥闯龌ㄉ跁窀蛇^程中后熟作用劇烈[35]，蛋白質(zhì)仍在不斷合成中，主要過敏原含量有所增加，其中帶殼曬干的花生中過敏原Ara h 1的合成作用比去殼曬干的花生更強(qiáng)。

圖3 曬干處理對花生主要過敏原蛋白含量的影響Fig. 3 Effect of sun-drying on the contents of major allergen proteins in peanut

2.3 曬干處理對花生蛋白結(jié)構(gòu)的影響

圖4 曬干處理對花生蛋白結(jié)構(gòu)的影響Fig. 4 Effect of sun-drying treatment on the structure of peanut proteins

表1 花生蛋白二級結(jié)構(gòu)經(jīng)不同曬干處理后各構(gòu)象單元含量變化Table 1 Secondary structure contents of peanut proteins extracted after different drying treatments

蛋白質(zhì)的CD光譜反映了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的信息，由圖4A可以看出，新鮮花生的蛋白CD譜圖在193 nm波長處有一正峰，212 nm波長處有一個(gè)負(fù)峰，說明新鮮未處理的花生蛋白存在α-螺旋結(jié)構(gòu)，含量為6.1%。去殼曬干處理后，α-螺旋含量增加了109.8%，達(dá)到12.8%，而其他3 種構(gòu)象單元的含量均相應(yīng)降低，說明去殼曬干處理后花生蛋白變得更加有序。但帶殼曬干處理后，α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量都有所降低，而無規(guī)卷曲含量有所增加，說明帶殼曬干后花生蛋白變得更加無序。結(jié)果表明，不同曬干方式會對花生蛋白的二級結(jié)構(gòu)造成不同的影響。

圖4B顯示了蛋白質(zhì)分子中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等殘基的紫外吸收，吸收峰約在250～280 nm處[36-37]。經(jīng)去殼曬干處理后，花生蛋白在250～285 nm波段內(nèi)紫外吸收強(qiáng)度低于新鮮花生，但在285～350 nm波段內(nèi)與新鮮花生的紫外吸收強(qiáng)度相差不大；而經(jīng)帶殼曬干處理后，花生蛋白在250～325 nm波段內(nèi)比新鮮花生的紫外吸收強(qiáng)度低，在325～350 nm波段內(nèi)比新鮮花生的紫外吸收強(qiáng)度高。結(jié)果表明曬干處理后，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)都變緊湊，且去殼曬干花生結(jié)構(gòu)更為緊湊。

2.4 曬干處理對花生過敏原蛋白潛在致敏性的影響

圖5 曬干處理對花生過敏原蛋白的IgE結(jié)合能力的影響Fig. 5 Effect of sun-drying treatment on IgE-binding capacity of major allergen proteins in peanut

血清IgE結(jié)合能力常用于比較花生蛋白的潛在致敏性[36]。競爭抑制率越低，競爭抗原與過敏患者血清的結(jié)合能力越弱，即潛在致敏性越低。不同曬干處理后花生蛋白IgE結(jié)合能力如圖5所示。經(jīng)曬干處理后，花生的潛在致敏性顯著增強(qiáng)，而帶殼曬干的花生潛在致敏性最強(qiáng)，其半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值（0.9 mg/mL）僅為新鮮花生IC50值（3.6 mg/mL）的25%。與烘烤花生的研究結(jié)果一致[16]，干燥處理會使花生過敏原蛋白的潛在致敏性增強(qiáng)[17]。這也與過敏原蛋白的數(shù)量有關(guān)，曬干過程中，主要過敏原蛋白含量顯著增加，花生過敏原蛋白潛在致敏性就相應(yīng)增強(qiáng)；而去殼曬干的花生結(jié)構(gòu)較帶殼曬干的花生更緊湊，這可能導(dǎo)致其IgE結(jié)合能力弱于帶殼曬干的花生。

3 結(jié) 論

曬干處理后，花生總蛋白含量減少，其中去殼曬干花生蛋白減少了0.74 g/100 g，帶殼曬干花生減少了3.25 g/100 g。花生中可提取蛋白的總量基本不變，但提取獲得的過敏原蛋白含量明顯增加，特別是Ara h 3/4，在去殼曬干花生中的含量增長了69.97%，帶殼曬干花生中增長了62.60%，這會導(dǎo)致花生潛在致敏性的增強(qiáng)。帶殼曬干和去殼曬干2 種方式對花生蛋白結(jié)構(gòu)的影響也不同，去殼曬干花生中提取到的蛋白中，α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量增長了109.8%，二級結(jié)構(gòu)更為有序，三級結(jié)構(gòu)更為緊湊，這導(dǎo)致其潛在致敏性弱于帶殼曬干的花生。

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