流式細(xì)胞術(shù)在超高壓誘導(dǎo)大腸桿菌O157:H7亞致死研究中的應(yīng)用

孔曉雪，韓衍青，付 勇，姬賽賽，王嫻靜，禹金龍，江 蕓,*

大腸桿菌O157:H7是最常見的食源性致病菌之一，在世界范圍內(nèi)普遍存在，廣泛分布于水、土壤和食物中，肉類、蔬菜、水果等均可成為傳染源[1-3]，目前已被WHO列為食品中四大食源性致病菌之一。我國食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)近年的資料顯示，我國在生肉、熟肉、蔬菜中均受到大腸桿菌O157:H7不同程度的污染，尤其是在生牛肉中感染幾率尤其高[4-5]，大腸桿菌O157:H7感染存有爆發(fā)的可能性，應(yīng)引起高度重視[6-7]。

大腸桿菌O157:H7屬于革蘭氏陰性短桿菌，兼性厭氧，菌體兩端鈍圓，無芽孢，有周鞭毛，大多數(shù)菌株有莢膜；培養(yǎng)18～24 h后，菌落呈圓形凸起，邊緣齊整，直徑為1～15 mm，是腸出血性大腸桿菌的主要病原血清型，同時也是一種重要的人畜共患病原菌[8]。

流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）可以對被熒光染色的單個細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析，可以通過檢測熒光信號監(jiān)測細(xì)胞膜完整性、細(xì)胞生理代謝活動、細(xì)胞凋亡周期、膜電位等細(xì)胞特性并分選出特定狀態(tài)的細(xì)胞群體[9]。熒光染料碘化丙啶（propidium iodide，PI）是一種可對DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，是一種溴化乙啶的類似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光，不能通過完整的細(xì)胞膜，但能穿過破損的細(xì)胞膜而對核染色。PI-DNA復(fù)合物的激發(fā)和發(fā)射波長分別為535 nm和615 nm。SYBR Green Ⅰ是一種可以透過完整細(xì)胞膜結(jié)合于所有DNA雙螺旋小溝區(qū)域的綠色熒光染料。在游離狀態(tài)下，SYBR Green Ⅰ發(fā)出微弱的熒光，與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)，SYBR Green Ⅰ的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為497 nm和520 nm[10-12]。

超高壓（high hydrostatic pressure，HHP）處理可有效抑制食品中的腐敗菌和致病菌，是目前食品工業(yè)運(yùn)用最廣泛的非熱加工技術(shù)之一，其殺菌機(jī)制主要與細(xì)菌細(xì)胞膜破壞、核酸結(jié)構(gòu)變化、胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性、關(guān)鍵酶活性降低等有關(guān)[13-15]。超高壓處理后的微生物細(xì)胞存在3 種不同生理狀態(tài)：即正常細(xì)胞、處于損傷狀態(tài)的細(xì)胞（亞致死細(xì)胞）和死亡細(xì)胞[16-17]。1951年Hartsell最先將亞致死菌定義為一種在營養(yǎng)豐富的非選擇性培養(yǎng)基上能生長出正常菌落，而在選擇性培養(yǎng)基上無法生長出可見菌落的微生物的存在狀態(tài)，非選擇性培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基之間菌落數(shù)的差值，即為亞致死狀態(tài)菌的數(shù)目[18]。在超高壓處理過程中部分大腸桿菌O157:H7會處于亞致死狀態(tài)，流式細(xì)胞儀可以將不同生理狀態(tài)的細(xì)菌有效檢出，避免傳統(tǒng)培養(yǎng)方法在檢測亞致死菌過程中容易出現(xiàn)假陰性、造成漏檢、錯檢的情況，本研究采用PI和SYBR Green Ⅰ雙染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對超高壓處理后大腸桿菌O157:H7菌體細(xì)胞不同的存活狀態(tài)及細(xì)胞膜完整性進(jìn)行分析研究，以此評估通過單純超高壓殺菌處理是否可以有效避免大腸桿菌O157:H7帶來的食品安全隱患，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實超高壓處理后菌體細(xì)胞死亡機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

大腸桿菌O157:H7由中國工業(yè)微生物菌種保藏中心提供（編號CICC 21530）。

胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（tryptic soy agar with yeast extract，TSA-YE）、山梨醇麥康凱瓊脂（CT-sorbitol MacConkey agar base，CT-SMAC） 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 南京化學(xué)試劑有限公司；PI、SYBR GreenⅠ 美國Sigma公司；聚乙烯耐高壓包裝袋（240 mm×190 mm） 南京圣比澳生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UHPF/2L/600 MPa食品超高壓處理設(shè)備 包頭高新技術(shù)食品機(jī)械公司；絕對計數(shù)熒光微球 上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；FACSCalibur型全自動流式細(xì)胞儀 美國BD公司；FR-300手壓式塑料薄膜袋封口機(jī) 特力包裝機(jī)械有限公司；2-16KL 高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；WGZ-2XJ細(xì)菌濁度計 上海昕瑞儀器儀表有限公司；DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；ZQTY-70臺式振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；JSM-5610LV型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本電子株式會社；H-7650透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

取10 mL新鮮已滅菌的胰蛋白胨大豆肉湯，將大腸桿菌O157:H7單菌落接種于其上，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，再取活化好的菌懸液1 mL接種于50 mL已滅菌的新鮮的胰蛋白胨大豆肉湯中，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)菌種18 h至穩(wěn)定期，4 ℃、8 000×g離心5 min，棄上清液，用已滅菌的pH 7.0磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌菌體3 次，并將菌體重懸，用細(xì)菌濁度計調(diào)整菌懸液濃度至106CFU/mL，裝入無菌聚乙烯耐高壓包裝袋中，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 超高壓處理

菌懸液樣品于25 ℃條件下超高壓（200、400、500 MPa）處理5 min（加壓處理時間不包括升、卸壓所用時間），處理介質(zhì)為水。超高壓處理后的樣品立即于冰上保存。

1.3.3 流式細(xì)胞儀對健康菌和熱致死菌存活狀態(tài)的檢測

梯度混合健康菌和熱致死菌（1 0 0 ℃、30 min），混合后的活菌率為0%、25%、50%、75%、100%。向各組混合菌懸液中分別加入50 μL PI和1 μL SYBR GreenⅠ[19-20]，搖勻，37 ℃放置30 min。染色過程在避光條件下進(jìn)行，染色結(jié)束后，4 ℃、8 000×g離心5 min，用PBS洗滌2 次，去除多余的染色劑，重新懸浮，加入絕對計數(shù)熒光微球用流式細(xì)胞儀檢測計數(shù)。細(xì)胞采集數(shù)為104，流速為600 個/秒，F(xiàn)L1通道收集SYBR GreenⅠ熒光，F(xiàn)L3通道收集PI熒光，作計數(shù)結(jié)果與梯度配比熱處理細(xì)胞的相關(guān)性分析，以驗證實驗方法的精確度。

1.3.4 超高壓處理后大腸桿菌O157:H7存活狀態(tài)的檢測

經(jīng)200、400、500 MPa超高壓處理的菌懸液中分別加入50 μL PI和1 μL SYBR GreenⅠ，搖勻，37 ℃放置30 min。染色過程在避光條件下進(jìn)行，染色結(jié)束后，4 ℃、8 000×g離心5 min，用PBS洗滌2 次，去除多余的染色劑，重新懸浮，加入絕對計數(shù)熒光微球[21-23]用流式細(xì)胞儀檢測計數(shù)。細(xì)胞采集數(shù)為104，流速為600 個/秒，F(xiàn)L1通道收集SYBR GreenⅠ熒光，F(xiàn)L3通道收集PI熒光，采用Cell-Quest軟件采集數(shù)據(jù)。

1.3.5 超高壓處理后大腸桿菌O157:H7菌落總數(shù)測定

無菌操作條件下各超高壓處理組樣品各1 mL用已滅菌的pH 7.0 PBS進(jìn)行梯度稀釋，選擇合適的稀釋度分別用TSA-YE和CT-SMAC[24-25]進(jìn)行平板涂布計數(shù)。平板計數(shù)操作按照GB 4789.2—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》進(jìn)行。陽性對照組為未經(jīng)超高壓處理的菌懸液樣品，陰性對照組為100 ℃沸水浴30 min，熱滅活的菌懸液樣品。

1.3.6 超高壓處理后大腸桿菌O157:H7微觀形態(tài)變化

1.3.6.1 SEM觀察

收集未經(jīng)超高壓處理以及分別經(jīng)200、400、500 MPa超高壓處理后大腸桿菌O157:H7菌懸液80 mL，4 ℃、8 000×g離心5 min，收集菌體，加入預(yù)冷的2.5%戊二酸溶液4 ℃固定4 h，用無菌PBS（pH 7.4）漂洗3 次，經(jīng)50%、70%、80%、90%的乙醇順序梯度脫水各15 min，再用100%乙醇脫水3 次，每次20 min。脫水后樣品用乙酸異戊酯置換3 次，每次20 min，置換后的樣品進(jìn)行冷凍干燥，離子濺射儀鍍金（厚度約10 nm），樣品處理好后于JSM-5610LV型SEM觀察菌體結(jié)構(gòu)變化[18,26]。

1.3.6.2 TEM觀察

收集未經(jīng)超高壓處理以及分別經(jīng)200、400、500 MPa超高壓處理后大腸桿菌O157:H7菌懸液80 mL，4 ℃、8 000×g離心5 min，收集菌體，加入預(yù)冷的2.5%戊二酸溶液4 ℃固定4 h，2%瓊脂預(yù)包埋，用無菌PBS（pH 7.4）漂洗2 次，2%鋨酸固定1 h，用無菌PBS（pH 7.4）漂洗3 次，經(jīng)30%、50%、70%、90%、無水乙醇梯度脫水各1次，每次15 min，再用無水丙酮脫水2次，環(huán)氧樹脂Epon812包埋，梯度烘干，采用超薄切片機(jī)切成厚度為70 nm的樣品，用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染于H-7650 TEM下觀察菌體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)變化[18,26]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行進(jìn)行單因素方差分析及Duncan’s多重比較檢驗（P＜0.05），對流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)用Flowjo 7.6.1進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙染色法精確度實驗

SYBR GreenⅠ可以透過完整細(xì)胞膜能進(jìn)入活菌的胞內(nèi)與核酸物質(zhì)結(jié)合，PI不能透過完整細(xì)胞膜只能透過破損的細(xì)胞膜進(jìn)入死菌胞內(nèi)與核酸物質(zhì)結(jié)合。但PI與核酸物質(zhì)的親和性優(yōu)于SYBR GreenⅠ，一旦進(jìn)入胞內(nèi)可以取代SYBR GreenⅠ的結(jié)合位點(diǎn)；SYBR GreenⅠ的發(fā)射波長與PI的激發(fā)波長相近，當(dāng)兩種熒光物質(zhì)同時存在時，在熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用下會使綠色熒光減弱，紅色熒光增強(qiáng)[10,27]，在這兩種作用下使得死菌只顯示紅色熒光，而活菌顯示綠色熒光。通過流式細(xì)胞儀分選不同熒光信號的細(xì)胞并對其計數(shù)，計算活菌/死菌比例與梯度配比做相關(guān)性驗證。

實驗結(jié)果表明SYBR GreenⅠ與PI雙染色法能夠?qū)⒒罹?死菌梯度配比溶液中的活菌和死菌有效區(qū)分開。在梯度配比溶液中加入絕對計數(shù)微球后能精確對顯示不同熒光顏色的細(xì)胞計數(shù)，按計數(shù)結(jié)果計算顯示綠色熒光的細(xì)胞（FL1通道收集的細(xì)胞）占總細(xì)胞（FL1通道與FL3通道收集的細(xì)胞之和）的比例（y），其結(jié)果與梯度配比中健康菌所占比例（x）幾乎一致，（y＝0.994 7x，R2＝0.997 9），表明流式細(xì)胞儀雙染色法能夠準(zhǔn)確鑒別大腸桿菌O157:H7的死活狀態(tài)并對死、活菌分別精確計數(shù)。

2.2 超高壓處理后大腸桿菌O157:H7存活狀態(tài)檢測結(jié)果

圖1 超高壓處理后大腸桿菌O157:H7雙染后流式細(xì)胞二維點(diǎn)圖Fig. 1 Flow cytrometric ぼuorescence dot plots for E. coli O157:H7 subjected ti different pressure treatments

經(jīng)超高壓處理后大腸桿菌O157:H7流式細(xì)胞儀雙染色結(jié)果如圖1所示。門Q1內(nèi)的菌顯示綠色熒光是只能被SYBR GreenⅠ染色的存活菌具有完整的細(xì)胞膜。門Q2內(nèi)的菌同時顯示綠色熒光和紅色熒光（圖中未能顯示，后同）為損傷菌，損傷菌能同時顯示綠色熒光和紅色熒光是因為這部分菌細(xì)胞膜出現(xiàn)損傷使一部分PI進(jìn)入胞內(nèi)，但由于細(xì)胞膜只是部分損傷進(jìn)入胞內(nèi)的PI量較少，不足以完全取代SYBR GreenⅠ與核酸物質(zhì)結(jié)合，所以使這部分細(xì)胞同時顯示綠色熒光與紅色熒光[10]。門Q3內(nèi)的菌是被PI染色顯示紅色熒光的死亡菌。門Q4內(nèi)的菌是少量沒有被染色劑染色的菌，沒有熒光信號或信號很弱。

經(jīng)200 MPa處理后60.3%的菌在門Q1內(nèi)，18.7%的菌在門Q2內(nèi)，19.3%的菌在門Q3內(nèi)，1.2%的菌在門Q4內(nèi)，結(jié)果表明經(jīng)200 MPa處理60.3%的菌具有完整細(xì)胞膜不能被PI染色，18.7%的菌細(xì)胞膜出現(xiàn)破損同時被PI與SYBR GreenⅠ染色，19.3%的菌細(xì)胞膜的選擇透過性完全喪失，使大量PI透過細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)而使細(xì)胞顯示紅色熒光，這部分菌通常被認(rèn)為是死亡菌[10,27-28]。

經(jīng)400 MPa處理后28.6%的菌在門Q1內(nèi)，35.6%的菌在門Q2內(nèi)，35.4%的菌在門Q3內(nèi)，0.2%的菌在門Q4內(nèi)，結(jié)果表明經(jīng)400 MPa處理28.6%的菌具有完整細(xì)胞膜不能被PI染色，35.6%的菌細(xì)胞膜出現(xiàn)破損同時被PI與SYBR GreenⅠ染色，35.4%的菌是死亡菌。

經(jīng)500 MPa處理后0.89%的菌在門Q1內(nèi)，30.2%的菌在門Q2內(nèi)，68.1%的菌在門Q3內(nèi)，0.52%的菌在門Q4內(nèi)，結(jié)果表明經(jīng)500 MPa處理0.89%的菌具有完整細(xì)胞膜不能被PI染色，30.2%的菌細(xì)胞膜出現(xiàn)破損同時被PI與SYBR GreenⅠ染色，68.1%的菌是死亡菌。

2.3 超高壓處理后大腸桿菌O157:H7傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果

經(jīng)不同壓力處理后的大腸桿菌O157:H7采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法進(jìn)行菌落計數(shù)。將各組菌液進(jìn)行梯度稀釋，選擇3 個合適的稀釋度，分別吸取100 μL經(jīng)選擇性培養(yǎng)基（CT-SMAC）和非選擇性培養(yǎng)基（TSA-YE）進(jìn)行平板涂布培養(yǎng)，結(jié)果如表1所示。

表1 不同壓力處理后TSA-YE和CT-SMAC對大腸桿菌O157:H7平板涂布計數(shù)結(jié)果Table 1 Counts of E. coli O157:H7 undergoing different pressure treatments determined using TSA-YE and CT-SMAC

健康菌和損傷菌均能在非選擇性平板TSA-YE上培養(yǎng)，而選擇性平板CT-SMAC上只有健康菌可以生長，因此非選擇性平板上菌落數(shù)與選擇性平板上菌落數(shù)的差值可以反映損傷菌的菌體數(shù)量。不同壓力處理，2 種平板計數(shù)結(jié)果的差值不同，表明不同壓力水平處理產(chǎn)生的損傷狀態(tài)的菌體數(shù)量不同。超高壓處理后大腸桿菌O157:H7傳統(tǒng)計數(shù)結(jié)果可以驗證流式細(xì)胞儀雙染色法對超高壓處理后大腸桿菌O157:H7存活狀態(tài)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

超高壓處理后大腸桿菌O157:H7傳統(tǒng)計數(shù)結(jié)果如表1所示。陽性對照組兩種培養(yǎng)基平板涂布計數(shù)結(jié)果無顯著差異，陰性對照組兩種培養(yǎng)基上都沒有檢出菌落。200 MPa下TSA-YE平板計數(shù)結(jié)果為5.2 lg（CFU/mL），CTSMAC平板計數(shù)結(jié)果為4.1 lg（CFU/mL），兩者差值表示亞損傷狀態(tài)菌的數(shù)量級，其差值為1.1 lg（CFU/mL）；400 MPa下TSA-YE平板計數(shù)結(jié)果為3.9 lg（CFU/mL），CT-SMAC平板計數(shù)結(jié)果為1.7 lg（CFU/mL），2 種平板計數(shù)結(jié)果的差值為2.2 lg（CFU/mL）；500 MPa下TSA-YE平板計數(shù)結(jié)果為1.8 lg（CFU/mL），CT-SMAC平板沒有檢出菌落，2 種平板計數(shù)結(jié)果的差值為1.8 lg（CFU/mL）。平板涂布計數(shù)結(jié)果與流式細(xì)胞儀雙染色法檢測結(jié)果相比，經(jīng)超高壓處理后大腸桿菌O157:H7存活菌、亞損傷菌與死亡菌數(shù)量級分布是一致的。

2.4 SEM觀察超高壓處理后大腸桿菌O157:H7形態(tài)學(xué)變化

圖2 超高壓處理后大腸桿菌O157:H7 SEM圖Fig. 2 Scanning electron microscopic images of E. coli O157:H7 treated with high hydrostatic pressure processing

由圖2可知，未經(jīng)超高壓處理組細(xì)胞具有典型的桿狀外形，細(xì)胞體表面規(guī)整，邊緣光滑，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜完整，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。經(jīng)200 MPa處理后少量菌體出現(xiàn)表面凹陷，大部分菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，菌體飽滿表面光滑。400 MPa處理后部分菌體出現(xiàn)表面凹陷，菌體表面出現(xiàn)褶皺，邊緣粗糙。500 MPa處理后大部分菌體外觀有顯著變化，菌體表面出現(xiàn)褶皺，邊緣粗糙，有內(nèi)容物外泄。

2.5 TEM觀察超高壓處理后大腸桿菌O157:H7形態(tài)學(xué)變化

圖3 超高壓處理后大腸桿菌O157:H7 TEM圖Fig. 3 Transmission electron microscopic images of E. coli O157:H7 treated with high hydrostatic pressure processing

由圖3可知，未處理組大腸桿菌O157:H7菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、清晰。細(xì)胞壁邊緣整齊光滑，細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)膜之間無明顯間隙，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，菌體呈較規(guī)則的桿狀，無明顯褶皺。200 MPa處理后的大腸桿菌O157:H7部分菌體開始出現(xiàn)細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜局部分離，細(xì)胞中心出現(xiàn)大面積光透明區(qū)，電子密度較低的陰影區(qū)從中心向細(xì)胞質(zhì)膜靠近，但大部分菌體依然呈較規(guī)則的桿狀，細(xì)胞質(zhì)均勻分布。經(jīng)400 MPa處理的大腸桿菌O157:H7，大部分菌體細(xì)胞嚴(yán)重變形，細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜分離，層次不清，部分菌體細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，光透明區(qū)出現(xiàn)絲狀物。經(jīng)500 MPa處理的大腸桿菌O157:H7，菌體細(xì)胞嚴(yán)重變形，菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜嚴(yán)重分離，且層次不清，電子密度較低的陰影區(qū)從中心向細(xì)胞質(zhì)膜靠近，并凝集成塊，個別菌體細(xì)胞壁模糊不清，細(xì)胞膜破裂。菌體內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生更明顯變化，光透明區(qū)出現(xiàn)大量輻射絲狀物，核糖體變的清晰可見。

本實驗采用SEM、TEM觀察和分析超高壓處理對大腸桿菌O157:H7形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，超高壓可導(dǎo)致大腸桿菌O157:H7外部形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)的顯著變化，對菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜有顯著的破壞作用，且這種破壞作用隨壓力升高而增大，當(dāng)壓力達(dá)到500 MPa時，細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜幾乎被完全破壞，細(xì)胞嚴(yán)重變形。

3 討 論

對超高壓等外力作用后微生物菌體細(xì)胞的生理狀態(tài)研究能夠使我們更好地理解微生物世界。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)研究微生物細(xì)胞的死亡、存活和損傷狀態(tài)近年來得到學(xué)者的廣泛認(rèn)可和關(guān)注，關(guān)于損傷菌的研究近幾年也日趨增多。本研究選擇SYBR-GreenⅠ、PI兩種生物學(xué)染料對超高壓處理后的食源性致病菌大腸桿菌O157:H7進(jìn)行染色、流式細(xì)胞儀分析，并結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和電子顯微鏡技術(shù)，有效揭示出超高壓對菌體細(xì)胞的破壞作用及其不同的生理生化特性。首先，通過健康菌/死菌梯度配比實驗驗證了SYBR GreenⅠ、PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)對大腸桿菌O157:H7死活菌檢測計數(shù)的精確度，實驗結(jié)果表明雙染色流式細(xì)胞術(shù)能夠準(zhǔn)確區(qū)分梯度配比混合菌液中的活菌和死菌，并對活菌和死菌能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確計數(shù)。其次，采用SYBR GreenⅠ、PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)對經(jīng)200、400、500 MPa超高壓處理的菌懸液進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測，分析不同壓力處理后菌體細(xì)胞的存活狀態(tài)。結(jié)果表明超高壓對大腸桿菌O157:H7有明顯的致死效果，并能使大腸桿菌O157:H7細(xì)胞膜出現(xiàn)明顯損傷，這一研究結(jié)果與Ananta等[29]關(guān)于Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103壓力致死機(jī)制的研究結(jié)果是一致的。在實驗壓力范圍內(nèi)，隨壓力升高，大腸桿菌O157:H7細(xì)胞膜損傷程度增加，細(xì)菌細(xì)胞死亡率增加，在400 MPa下處于亞損傷狀態(tài)的細(xì)菌細(xì)胞最多，占細(xì)菌細(xì)胞總數(shù)的35.6%，在500 MPa壓力處理下也依然有30.2%的細(xì)菌細(xì)胞處于亞損傷狀態(tài)。同時對經(jīng)200、400、500 MPa超高壓處理的菌懸液進(jìn)行選擇性培養(yǎng)基（CT-SMAC）和非選擇性培養(yǎng)基（TSA-YE）平板涂布培養(yǎng)，結(jié)果與SYBR GreenⅠ、PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果一致，即使在500 MPa壓力處理下依然有一部分菌處于亞損傷狀態(tài)，這部分菌不能在CT-SMAC平板上生長，但可以在TSA-YE平板上生長。這一結(jié)果與Mariana[30]、Maresca[31]等的研究所揭示的結(jié)果相同。最后，通過SEM和TEM對經(jīng)200、400、500 MPa超高壓處理的菌懸液進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果表明超高壓使大腸桿菌O157:H7細(xì)菌細(xì)胞變形，細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜破裂，內(nèi)部形態(tài)改變，這與前文流式細(xì)胞術(shù)的分析結(jié)果和陸海霞等[13]的研究在一定程度上所揭示的情況是一致的。

綜上所述，400 MPa以上的超高壓對大腸桿菌O157:H7有較好的致死作用，當(dāng)處理壓力達(dá)到500 MPa時幾乎多有菌體都受到損傷或死亡，超高壓對細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞作用很可能是其主要致死機(jī)制之一。即使在500 MPa壓力處理下依然有30.2%的菌處于亞致死狀態(tài)，這部分菌是否會在食品貨架期內(nèi)帶來安全隱患尚需進(jìn)一步評估。

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