郭全友，朱彥祺,2，姜朝軍，李保國

0 引 言

大黃魚（pseudosciaena crocea）是中國地方性海水魚類，在中國漁業(yè)經濟占據(jù)重要地位[1]。目前，輕腌加工已成為大黃魚主要加工形式，加工后水產品食用方便、營養(yǎng)價值高，但由于其高蛋白、高含水率容易受到微生物污染，導致腐敗變質和食品安全問題。

鮮大黃魚室溫下的特定腐敗菌為弧菌和腸桿菌[2]，弧菌能黏附于大黃魚的黏液，從而在儲藏過程中導致大黃魚的腐敗。其中，溶藻弧菌（vibrio alginolyticus）為嗜鹽嗜溫性、兼性厭氧海生弧菌，廣泛分布于世界各地海水及河口，數(shù)量居海水類弧菌之首[3]，適宜生長溫度為17～35 ℃。Hilmer等[3]研究證明，溶藻弧菌為32 ℃儲藏條件下鲯鰍的優(yōu)勢腐敗菌，能促使大量組胺的形成；同時近年來研究證明溶藻弧菌是引起牙鲆和鰻鱺等許多經濟魚類發(fā)生細菌性魚病的致病菌之一[4-5]，研究證實該菌與副溶血弧菌一樣，易污染食物引起腹瀉，能產生不耐熱性腸毒素（heat-labile toxins，LT）和耐熱性腸毒素（heat stable toxins，ST），是沿海地區(qū)食物中毒的常見的條件致病菌[6]。溶藻弧菌既能導致水產品的腐敗又是一種致病菌，多見于海水及水產品中，抑制溶藻弧菌的生長對產品質量安全至關重要。

目前主要可通過“柵欄技術”改變微生物的生長環(huán)境，來達到抑制微生物的作用。柵欄技術[7]中，多使用水分活度、鹽分、醋酸、Nisin、糖分等柵欄因子來控制微生物的生長。微生物的生長/非生長（growth/non- growth）界限可以通過數(shù)學模型來定義和描述，得到的數(shù)學模型可作為安全屏障參數(shù)，保證產品的安全性和穩(wěn)定性[8]。目前微生物的生長/非生長界限模型的建模方法有 Logistic回歸法[9]、最小多面體法[10]、人工神經網絡模型[11]法、簡化式法[11]等。Logistic回歸是模擬食品中微生物生長邊界（生長/非生長界面）常用的方法[12-16]，F(xiàn)ernandez-Navarro[17]與Dechuyffeleer[18]等都曾使用該模型建立微生物生長/非生長模型來控制微生物的生長。PNN人工神經網絡模型是前饋型神經網絡，具有強大的非線性模式分類能力，PNN神經網絡結構簡單、訓練速度快，在模式分類問題中，它可以利用線性學習算法來實現(xiàn)非線性學習算法的功能，同時具有非線性算法的高精確度等性質，在解決生長/非生長界面問題時可以對其進行分類，Simon等[19]利用PNN神經網絡模型對芽孢桿菌的生長情況進行了預測；Hajmeer等[20]使用PNN模型對細菌生長非生長數(shù)據(jù)進行建模分類。目前尚沒有研究對溶藻弧菌的生長非生長模型進行研究，同時將logistic模型與人工神經網絡模型對比能更好的對其生長界面進行預測。

本文主要研究了在25 ℃儲藏條件下，水分活度、pH值及鹽分的交互作用對輕腌大黃魚貨架期終點溶藻弧菌生長概率的影響，用Logistic回歸和PNN人工神經網絡建立該交互作用下的生長/非生長模型，比較3種影響因子對溶藻弧菌的生長抑制作用，及其生長動力學參數(shù)的變化。由此評估pH值、水分活度和鹽分許用范圍內水產品的穩(wěn)定性，定義的非生長條件可作為抑制微生物、保障食品質量安全的指南，從而實現(xiàn)有效的保存方法，確保輕腌大黃魚產品品質安全。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株S1為從25 ℃輕腌大黃魚貨架期終點分離的菌株，菌株占比 58.1%，輕腌大黃魚取自福建寧德某公司,鹽分2.0%，含水率60.79±2.24%，水分活度（water activity，aw）0.96±0.002，菌株經16sRNA及MIDI氣相鑒定后為溶藻弧菌（序列號：KY684259），4 ℃保存，S1每個月重新接種斜面保證活性。

1.2 試劑及儀器

胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soya broth，TSB）；胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基（tryptose soya agar，TSA）；1%鹽酸（NaCl）；1%氫氧化鈉（NaOH）；甘油和氯化鈉，國藥集團化學試劑有限公司。

pHS-3C pH計，上海雷磁儀器廠; AW LAB-Touch PMB35水分活度儀，大昌華嘉商業(yè)(中國)有限公司; 微生物生長測定儀: 芬蘭，Bioscreen公司; SW-CJ-1FB潔凈工作臺,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠; MIR-153低溫培養(yǎng)箱，日本三洋公司; QT-2漩渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司。

1.3 生長介質的制備

試驗設計為多因子交互試驗，使用TSB作為培養(yǎng)的介質。大部分弧菌類最大耐受aw為0.90～0.94，因此取aw為0.90、0.91、0.92、0.94、0.96共5個水平；一般魚類的 pH值為 6.6～6.8之間，弧菌類最大耐受 pH值為4.8～5.0之間[21]，因此取 pH值為 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0共6個水平；對市售輕腌大黃魚鹽分含量分析，86.8%的產品小于4.0%，考慮產品的特性，則設計在鹽分1%、2%、3%、4%共4個水平下進行試驗，共計120種情況，每種情況重復4次，參考文獻[22]和[23]選取90例數(shù)據(jù)作為訓練集，30例數(shù)據(jù)為驗證集，其中其他條件不改變、當aw為0.91時作為驗證集，aw為0.90、0.92、0.94、0.96均分數(shù)據(jù)為訓練集，訓練集與驗證集情況如表 1所示。制備時添加甘油調節(jié)aw，利用稀鹽酸和氫氧化鈉調節(jié)pH值，用pH計確認最后讀數(shù)。

表1 交互試驗訓練集與驗證集設計Table 1 Design of training and validation set of interactive experiment

1.4 菌懸液的制備與接種

菌株活化：取溶藻弧菌接種于無菌營養(yǎng)肉湯中，震蕩30 s，25 ℃培養(yǎng)24 h，劃線得到單菌落。

菌懸液制備：用無菌介質環(huán)挑取菌株，接種到10 mL無菌TSB試管中，37 ℃培養(yǎng)12 h。取1 mL培養(yǎng)液至9 mL無菌生理鹽水中得到10–1菌懸液，以此稀釋，制成10–1、10–2、10–3、10–4、10–5、10–6梯度菌懸液，各取 0.1 mL 涂布于TSA平板，37 ℃培養(yǎng)48 h計數(shù)，選取菌量約105CFU/mL菌懸液作為接種液。

調節(jié)過pH值、水分、鹽分的TSB溶液，經121 ℃滅菌處理，每孔180 μL接入200微孔板中，取105CFU/mL的接種液20 μL，確定最終接種液濃度為4.5×104CFU/ml，接種入孔，每個條件4組平行，1個空白，微生物生長測定儀BIOSCREEN中速震蕩25 ℃培養(yǎng)，7 d內每隔1 h測其OD600nm值。

1.5 生長/非生長邊界判別

當試驗結束時，微孔中出現(xiàn)明顯的沉淀物或混濁且OD 值讀數(shù)高于空白3倍則判定為生長[24-26]。判定為生長的條件下，取微孔中培養(yǎng)液100 μL在營養(yǎng)瓊脂平板上涂布，檢驗菌株是否仍為純菌株。當OD值為1～3倍空白之間時，涂布TSA瓊脂平板驗證，若平板出現(xiàn)典型菌落，且菌數(shù)大于初始菌量0.5 lgCFU/mL時，則判定為生長[16]。每種情況下的生長概率由重復孔的生長情況計算得到。若4孔中的2孔判定為生長則該情況下的生長概率為50%。

1.6 生長／非生長模型構建

1.6.1 Logistic模型構建

選定90例數(shù)據(jù)為訓練集用來建立模型。

簡單Logistic方程為基于Logit-Boost算法與簡單回歸函數(shù)通過 5折交叉驗證確定最優(yōu)迭代次數(shù)的方法，數(shù)據(jù)在培訓和測試中平均分配了5次，為最基礎的Logistic模型。選用簡單Logistic方程來擬合試驗數(shù)據(jù)[9]

其中PO為生長/非生長概率，bi（i為0~3）為擬合參數(shù)，NaCl為鹽分濃度（體積分數(shù)v/v）。

二階線性 Logistic方程是一種建立在一個多項式的邏輯回歸模型的算法，可避免對大系數(shù)的過度擬合[23]，使用二階線性Logistic回歸模型來擬合試驗數(shù)據(jù)

式中PO為生長/非生長概率，bi（i為0~9）為擬合參數(shù)，NaCl為鹽分濃度（體積分數(shù)v/v），若計算過程中該參數(shù)效果不顯著則剔除。

1.6.2 PNN人工神經網絡模型構建

概率神經網絡是基于Bayes分類規(guī)則與Parzen窗的概率密度函數(shù)估計方法發(fā)展而來的一種并行算法[27]，PNN的結構由輸入層、模式層、求和層、輸出層組成[28-29]。

將試驗數(shù)據(jù)歸一化后，根據(jù)試驗設計選取90例數(shù)據(jù)，鹽分、pH值和aw作為三維向量進入輸入層，進行訓練，輸出層神經元設定為1，結構概率≤0.5的記作非生長，大于0.5的記作生長。訓練完成后，將驗證集30例數(shù)據(jù)作為輸入，驗證訓練模型的準確性。

1.7 模型擬合優(yōu)度及預測力評價

1.7.1 擬合優(yōu)度評價

Logistic模型擬合優(yōu)度采用似然比測試（-2lnL，the likehood test）、赤池信息準則（AIC=-2lnL+2k，Akaike’s information criterion）、Hosmer–Lemeshow 測試（HL）和R2-Nagelkerke進行評價。-2lnL、AIC常用作對模型擬合優(yōu)度的評判，數(shù)值越小，證明擬合的效果越好。Hosmer-Lemeshow常用來評估模型的擬合優(yōu)度及任意數(shù)量的連續(xù)與分散的解釋變量[30]，數(shù)值越小，擬合效果越好，但其無法將標準偏差納入考慮，一個不理想的預測值也可能導致該值的升高，常結合R2-Nagelkerke值一起考慮，R2-Nagelkerke值主要反映了解釋變量與響應變量間的關系，其值越接近1，擬合優(yōu)度越好。

1.7.2 預測力評價

Logistic與 PNN神經網絡模型的預測力采用C-matrix獲得的正確率（fraction correct，F(xiàn)C）和假陽性率（false alarm rate，F(xiàn)AR）[29]，進行比較，F(xiàn)C值越接近于100%說明預測效果越好，F(xiàn)C值為預測值與實際值的吻合度，F(xiàn)AR為假陽性錯判率，可作為模型的預測準確度的參考。

其中 FC=(a+d)/(a+b+c+d)，F(xiàn)AR=b/(a+b)。

1.8 模型驗證

按試驗設計選取30例數(shù)據(jù)為驗證集用來驗證模型，帶入建立的Logistic模型與PNN模型中，通過FC和FAR驗證模型的準確度和預測力。

1.9 生長動力學參數(shù)擬合

參考修艷輝等[31]針對環(huán)境因子對大黃魚腐敗希瓦氏菌生長影響的計數(shù)法，采用Gompertz方程對溶藻弧菌生長情況進行擬合，得到其生長動力學參數(shù)。

式中y為OD值；x為時間，h；a1為最小OD值；b1為最大 OD值與最小 OD值之差；c1為比生長速率，h–1；d1為延滯期，h。

1.1 0 數(shù)據(jù)分析

模型擬合通過軟件Spss 18.0，通過Origin9.0繪制生長/非生長曲線（選取概率PO＝0.1、0.5、0.9時的預測值）。

人工神經網絡建立通過MatlabR2016b建模。

2 結果與分析

2.1 生長/非生長模型構建及評價

2.1.1 Logistic回歸模型擬合

溶藻弧菌3種生長/非生長模型的擬合參數(shù)如表2所示。表2可見，采用簡單Logistic方程，鹽分、aw與pH對溶藻弧菌生長影響極顯著（顯著性 P<0.01），采用二階線性Logistic方程，aw、pH值、鹽分與pH值交互作用、pH值與aw交互作用對溶藻弧菌生長影響極顯著（顯著性P<0.01），分別擬合得到式（4）與式（5）。

表2 Logistic模型擬合參數(shù)及擬合優(yōu)度比較Table 2 Comparison of Logistic model fitting parameters and goodness of fit

2.1.2 PNN模型的建模結果

建立隱含層數(shù)2，輸出層神經元1的PNN模型。網絡建立后，開始訓練網絡，網絡訓練最優(yōu)速度為0.1 s，訓練集正確率為95.6%，按照試驗設計選取30例數(shù)據(jù)進行驗證。PNN 網絡的測試診斷結果顯示 30例驗證中有27例數(shù)據(jù)符合實際試驗情況分類，準確率為90.0%。

2.1.3 3種模型擬合優(yōu)度評價與驗證

模型擬合優(yōu)度參數(shù)如表3所示，正確率（FC）通常表示模型的預測能力[29]，簡單Logistic方程訓練集、驗證集的FC分別為87.5%與83.3%，二階線性Logistic方程訓練集、驗證集的 FC為 94.80%與 90.90%，優(yōu)于簡單logistic方程。同時二階線性Logistic方程的R2-Nagelkerke為0.91，Hosmer-Lemeshow為x2=0.55（P=1.00），假陽性率與假陰性率均優(yōu)于簡單Logistic方程。陳琛等[22]利用二階線性logistic方程建立了環(huán)境因子交互作用下蠟樣芽孢桿菌生長/非生長模型，結果顯示logistic回歸模型擬合度較高，具有較廣的適用范圍。渠飛翔等[24]利用二階線性 logistic方程建立了軟烤貽貝中蠟樣芽孢桿菌生長/非生長界面的模型，結果顯示該模型在預測軟烤貽貝中蠟樣芽孢桿菌的生長/非生長情況有很高的精確度和很好的適用性。

對于 PNN神經網絡模型來說其訓練集 FC高達95.6%，驗證集FC為90.0%，但訓練集和驗證集的假陽性率卻較 Logistic模型要高。PNN人工神經網絡模型能夠短時間內進行生長/非生長數(shù)據(jù)的快速分類，且總體準確率較高，但僅僅能對生長非生長數(shù)據(jù)進行分類，無法準確給出生長/非生長的界面，無法給出具體細致的生長概率，但其快速的分類功能卻能為工業(yè)生產提供便利。3種模型擬合優(yōu)度結果顯示，二階線性Logistic方程更能有效預測溶藻弧菌生長/非生長概率，能用于環(huán)境因子交互作用下溶藻弧菌生長/非生長概率變化趨勢。

表3 三種模型擬合優(yōu)度評價和比較Table 3 Evaluation and comparison of goodness fitting of three models

2.2 環(huán)境因子對溶藻弧菌生長概率的影響

2.2.1 鹽分對溶藻弧菌生長/非生長的作用

圖1為NaCl對溶藻弧菌生長概率影響的示意圖，根據(jù)模型擬合出生長概率 PO=0.1、0.5、0.9的生長概率分界線，在PO=0.9界限之上則代表該種對應條件下生長概率大于0.9，該條件適宜生長；在PO=0.1以下則說明該區(qū)域下鹽分、pH值及水分活度的交互作用對溶藻弧菌有較好的抑制作用，溶藻弧菌的生長概率小于 0.1。隨著鹽分的增大，生長非生長的界限明顯向低水分活度，低pH值方向移動，水分活度和pH值的交互作用逐漸減弱；PO=0.1到PO=0.9之間的距離也逐漸增大，生長/非生長的轉變區(qū)域逐漸增大，溶藻弧菌在鹽分4.0%時生長最為活躍。

圖1 對溶藻弧菌生長概率的影響Fig.1 Influence of the growth probability of Vibrio alginolyticus by NaCl

圖2 中為1.0%～4.0% NaCl和不同aw條件下，生長概率隨pH值增大的變化情況。鹽分1.0%、aw為0.96時，生長概率在pH值為4.6時開始增大，隨pH的增大生長概率逐漸增大最終達到1；aw為0.94條件下，生長概率在pH值為4.8時開始增大；aw為0.92、0.91條件下生長概率分別在pH值為5.3、5.9時開始增大，最終到達1和0.28；鹽分1.0%、aw為0.90時，無論pH值如何變化，該交互作用下溶藻弧菌均不生長。

圖2 鹽分（NaCl）、水分活度和pH值交互作用下溶藻弧菌的生長概率Fig.2 Growth probability of Vibrio alginolyticus under interaction effects of salt (NaCl)、aw and pH uallue

鹽分2.0%時，aw為0.96、0.94、0.92條件下，生長概率在pH值為4.5時均為0，隨pH值的增大生長概率逐漸增大最終達到1；aw為0.91條件下，生長概率在pH值為4.7時開始增大，在pH值為7時達到0.94；鹽分2.0%、aw為0.90時，無論pH值如何變化，該交互作用下溶藻弧菌均不生長。

鹽分3.0%、4.0%時，aw為0.91條件下，生長概率在分別在pH值為4.7、4.5時開始增大最終到達1，與鹽分1.0%、2.0%不同，當鹽分為3.0%、4.0%時，aw為0.90條件下生長概率在pH值為5.1、4.6時開始增大，最終到達0.42和1。鹽分越高，pH與aw的交互作用就被減弱，溶藻弧菌越適宜生長，生長界限開始變化的點趨于低pH值范圍。但是，通常高鹽分對腐敗菌有生長抑制作用[31]，其機理在于高 Na+造成的高滲條件會導致細胞質失水從而引起質壁分離，進而膨壓下降，細胞生長變慢而停止，生長受到抑制甚至死亡。修艷輝等[31]對單因素條件下環(huán)境因子對腐敗希瓦氏菌的生長非生長界面做了研究，結果顯示在25 ℃時，腐敗菌的生長概率隨鹽分的增加而逐漸降低，當鹽分大于等于 12%時腐敗希瓦氏菌完全不生長。造成差異的主要原因在于菌類自身的特性有所不同，溶藻弧菌分離于 25 ℃輕腌大黃魚貨架期終點，為嗜鹽菌，對鹽分有較強的耐受性[3]，故在 4.0%鹽分條件下，可減弱pH值與aw的交互作用，減少生長抑制。

2.2.2 aw對溶藻弧菌生長/非生長的作用

aw為0.92、0.94、0.96時，溶藻弧菌的生長概率受鹽分影響逐漸減小，隨pH值的增大而增大。aw越高，pH值與鹽分的交互作用就被減弱，溶藻弧菌越適宜生長。Deschuyffeleer[18]研究了pH值、aw及酒精含量對高糖烘焙類食品中腐敗菌的生長抑制作用，結果顯示隨著aw從0.89下降到0.755，目標腐敗菌的生長受到抑制，生長概率逐漸降低。對于溶藻弧菌，當aw低于0.91時，鹽分與pH值的交互作用逐漸受到影響，溶藻弧菌的生長同樣也隨水分活度的下降受到抑制。

2.2.3 pH值對溶藻弧菌生長/非生長的作用

pH值為4.5時，溶藻弧菌的生長受到強烈抑制，pH值為5.0~6.5時，溶藻弧菌的生長概率發(fā)生明顯增長，aw為0.96、0.94、0.92條件下，生長概率在鹽分4%時均能上升到1，概率變化的起始點也趨向低鹽分梯度，aw為0.90條件下的生長概率也隨鹽分增大而增大最終到達0.86。Dang[7]研究了乙酸、aw、pH值對結合酵母生長非生長的交互作用，結果顯示，隨著pH值的降低，結合酵母的生長概率也隨之降低，生長界限向更低乙酸、更高aw方向偏移，證明了低pH值是影響結合酵母生長的主要因素，在低pH值范圍內pH值的改變只能引起生長概率微小的改變，高pH值范圍內pH值的改變可以引起生長概率巨大的變化，該結論與本文結果相同。

2.3 環(huán)境因子對溶藻弧菌生長動力學參數(shù)的影響

圖3為鹽分1.0%～4.0%條件下，交互作用對溶藻弧菌生長動力學參數(shù)的影響。如圖3a、圖3b所示，在鹽分1%時，比生長速率在aw為0.96且pH值為7時最大，為0.144± 0.006 h-1，且隨pH值的下降而減小，生長速率明顯減緩，同時該條件下的延滯期最小為 2.84±0.41 h；aw為0.94時，pH值為6時比生長速率為0.115±0.068 h-1，延滯期為10.56±0.37 h，延滯期隨pH值的減小而增大；aw為0.92時，比生長速率很小，pH值4.5～7范圍內的延滯期均大于30 h，生長遲緩，生長受到抑制。

圖3c、圖3d所示，在鹽分2.0%時，比生長速率在aw為0.96且pH值為7時最大，為0.099±0.003 h-1，小于鹽分1.0%時的比生長速率，但該條件下的延滯期比鹽分1.0%時的小，為1.27±0.21 h；aw為0.92時，比生長速率總體上隨pH的增大而增大，從0.027增長到0.072 h-1，大于鹽分1.0%的情況。

圖3e、圖3f所示，在鹽分3.0%時，aw為0.92時，比生長速率經顯著性分析明顯大于鹽分 1.0%，2%的情況，延滯期有明顯縮短，從1%時33 h左右縮短到15 h左右；aw為0.91時，溶藻弧菌也有緩慢生長。

圖3g、圖3h所示，在鹽分4.0%、aw為0.90時，溶藻弧菌有緩慢生長，比生長速率為 0.02～0.03左右，延滯期在17.3～43.5 h范圍內隨pH值的減小而增大。有學者[32]研究了腐敗菌隨溫度變化其生長動力學參數(shù)的變化，結果大多顯示比生長速率隨著溫度的升高而增大，溫度與延滯期及比生長速率均存在線性關系，但很少有學者深入探究腐敗菌生長動力學參數(shù)隨其他環(huán)境因子而變化的規(guī)律。

圖3 環(huán)境因子對溶藻弧菌生長動力學參數(shù)的影響Fig.3 Effects of environment factors on growth kinetics parameters of Vibrio alginolyticus

3 結 論

本文研究了環(huán)境因子對源自輕腌大黃魚的溶藻弧菌生長/生長界面和生長動力的影響。通過建立Logistic 生長/非生長模型，可以評估pH值、aw和鹽分許用范圍內的水產品穩(wěn)定性，同時PNN模型雖不能具體預測溶藻弧菌的生長概率大小，但可對生長和非生長進行分類，由于其預測分類速度很快，可以在工業(yè)生產中起到重要作用。同時，通過概率模型預測的非生長區(qū)域可為保障水產品質量安全而不使用化學防腐劑提供指導。另外，預測模型可作為相關抑菌因素影響的有用指標，進而實現(xiàn)有效的保存方法，確保輕腌大黃魚產品的穩(wěn)定性和安全。主要結論如下：

1）建立了溶藻弧菌簡單 logistic模型、二階線性Logistic模型和PNN人工神經網絡模型，來預測溶藻弧菌的生長/非生長情況。二階線性logistic模型和PNN人工神經網絡模型的訓練集正確率分別為94.8%和95.6%，驗證集正確率為90.9%和90.0%。PNN人工神經網絡的能對生長、非生長數(shù)據(jù)進行快速分類，但二階線性 logistic模型能更好的反映溶藻弧菌的生長概率預測。

2）隨著鹽分的升高，生長非生長的界限明顯向低aw、低pH值方向移動，PO＝0.1到PO＝0.9之間的距離也逐漸增大，生長非生長的轉變區(qū)域逐漸增大。溶藻弧菌為輕腌大黃魚中分離嗜鹽菌，對鹽分有較強的耐受性，在4.0%鹽分條件下，可減弱pH值與水分活度的交互作用，生長較為活躍。

3）在相同鹽分條件下，高aw且pH值較高時比生長速率較高，溶藻弧菌生長繁殖迅速，延滯期也相應縮短；隨著鹽分的升高，0.91與0.90低aw條件下溶藻弧菌也開始緩慢增長，但存在較長時間的延滯期。高鹽分下的交互作用使溶藻弧菌比生長速率增大，延滯期減小，對溶藻弧菌的生長有促進作用。

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