人腫瘤抑制因子folliculin的N端結(jié)構(gòu)原核表達純化

皮業(yè)勤，吳哲俊，申一凡，陳婷，陸昌瑞，張云龍

（東華大學 生物科學與技術(shù)研究所，上海 201620）

Birt-Hogg-Dube′（BHD）綜合征是一種常染色體顯性遺傳性疾病，1970年由Birt、Hogg和Dube三位加拿大醫(yī)生發(fā)現(xiàn)，臨床表現(xiàn)主要包括良性毛囊瘤、腎囊腫和腎腫瘤等[1-3]。直至2001年，對大量BHD綜合征患者遺傳連鎖分析才發(fā)現(xiàn)其致病與BHD基因（又稱FLCN基因）缺失或突變相關(guān)[4]。Nickerson，M.L.等探查了BHD綜合征患者的嫌色細胞腎癌與FLCN二次突變相關(guān)，暗示了FLCN是一個腫瘤抑制基因[5]；隨后對裸鼠皮下注射FLCN缺陷細胞株長出腫瘤和注射轉(zhuǎn)染野生型FLCN后顯著降低腫瘤發(fā)生率對比，證明了FLCN的腫瘤抑制功能[6-7]。這些研究確定了FLCN是一種腫瘤抑制因子，但其與BHD綜合征的致病關(guān)聯(lián)尚未明確。

FLCN基因位于常染色體17p11.2，編碼579個氨基酸的64kDa蛋白[8]。BLAST氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LCN與現(xiàn)已知蛋白都沒有顯著同源性[9]，但其在單細胞生物（酵母）到哺乳動物（咧齒類動物、犬類和人類）具有高度保守性[10]，表明FLCN是一種關(guān)鍵的細胞調(diào)控因子。目前，F(xiàn)LCN的結(jié)構(gòu)與功能研究仍處于模糊階段。2012年，Nookala R.K.等利用X射線衍射技術(shù)解析了FLCN C端341-566氨基酸區(qū)段（FLCN-CT）三維結(jié)構(gòu)，經(jīng)結(jié)構(gòu)比對發(fā)現(xiàn)其與DENN1B的DENN結(jié)構(gòu)域相似，推測FLCN-CT具有鳥苷酸交換因子（GEF）功能[11]，但這并不能解釋FLCN突變或缺失導致BHD綜合征的致病機理。筆者對FLCN二級結(jié)構(gòu)預測發(fā)現(xiàn)，其1-360aa.區(qū)段多為無序結(jié)構(gòu)，無序區(qū)域由于構(gòu)象多變而發(fā)揮重要的生物學功能[12]。FLCN基因進化分析發(fā)現(xiàn)它是一個進化上非常保守的基因，特別是100-230aa.這段序列[11]，說明FLCN的N端具有很重要的功能。

筆者使用的載體ppSUMO是pET28a改造而來的，表達的SUMO蛋白有助融合蛋白的高表達和溶解性[13]。在成功構(gòu)建ppSUMO-N362重組質(zhì)粒后，經(jīng)表達純化N362融合蛋白后切去標簽，可獲得純度80%的N362蛋白。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)N端多無序區(qū)域且保守區(qū)域100-230aa.有強疏水性，極易形成疏水性片段，推測其可能作為FLCN形成聚合體或轉(zhuǎn)運結(jié)合的區(qū)域?？傊?，這些研究將為進一步FLCN結(jié)構(gòu)與功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒ppSUMO、pET28a-FLCN由本實驗室保存，E.coli DH5α、E.coli BL21購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Phusion DNA聚合酶和ULP1酶、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自Thermo Scientific公司，限制性內(nèi)切酶 BamHI、XhoI和T4連接酶購自NEB公司；HRP-labeled 6×His 單抗購自Proteintech公司；Ni-NTA Agarose和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自QIAGEN公司，HiTrap Q FF 1mL強陰離子預裝柱購自美國GE公司，超濾管購自MERCK公司，其他無機鹽試劑均為國產(chǎn)分析純。高壓細胞破碎儀JNBIOJN-3000，蛋白純化層析儀SCG p100。

1.2 FLCN的二級結(jié)構(gòu)預測

在psipred網(wǎng)站（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred）上輸入人源FLCN的氨基酸序列可得到FLCN二級結(jié)構(gòu)無序性的預測，它是基于DISOPRED3版本的預測結(jié)果。在expasy網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protscale/)上輸入人源FLCN的氨基酸序列可得到其氨基酸親疏水性的預測結(jié)果。

1.3 ppSUMO-N362重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以pET28a-FLCN為PCR模板設(shè)計引物，N362 F：5'- ATACAT GGATCC AAT GCC ATT GTT GCC CTG TGTC -3'，N362 R：5'- ATACAT CTCGAG TTA ACG AAA ACT CGG TGC GC -3'（劃線部分為酶切位點）。用常規(guī)PCR程序進行擴增。對載體和PCR產(chǎn)物進行5'BamH I和3'XhoI雙酶切，切膠回收后用T4連接酶16℃連接過夜；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coil DH5α感受態(tài)細胞，搖菌抽提質(zhì)粒電泳檢測，條帶正確的送生工測序鑒定。

1.4 N362融合蛋白表達并親和純化

將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細胞中，涂布平板后挑取單克隆過夜培養(yǎng)。次日將菌液加到1L的TB培養(yǎng)基中37℃ 225r/min培養(yǎng)至OD6000.6左右，加入終濃度0.1mmol/LIPTG誘導劑16℃過夜表達。

對表達好的菌液進行3500r/min 4℃離心30 min，棄上清后在冰上加入20mL bind buffer（25mmol/LNa2HPO4pH 8.0，500 mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑）重懸菌沉，加入終濃度1mmol/LDMSF蛋白酶抑制劑，用高壓細胞破碎機在4～6℃下1×105～1.5×105kPa破碎細胞兩三次后，12 000 r/min 4℃離心1h。將上清加入預先用Bind Buffer（25 mmol/LNa2HPO4pH8.0，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑）處理的Ni-NTA親和層析柱中，重復結(jié)合兩次后，加入大量的Wash buffer（25 mmol/LNa2HPO4pH8.0，500 mmol/LNaCl，20 mmol/L咪唑)洗滌，雜蛋白洗去后用Elute buffer（25 mmol/L Na2HPO4pH 8.0，500 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑)洗脫目的蛋白；將洗脫液用30 kD超濾管濃縮保存。各組分用12%SDS-PAGE和Western blot進行檢測。

1.5 N362融合蛋白離子交換純化

N362融合蛋白的預測等電點是5.7，選用GE的HiTrap Q FF 1mL強陰離子預裝柱，用SCGp100蛋白純化層析系統(tǒng)來進行純化。先用5CV BufferB（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液pH8.0，500 mmol/L NaCl）清洗柱子后，再用10CV Buffer A（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液pH8.0）平衡柱子，設(shè)置程序：用Buffer A和 Buffer B設(shè)置從0到500 mmol/L NaCl鹽濃度梯度，共收集45mL，設(shè)置流速1mL/min，警報壓力0.3 MPa，每管收集1mL。進樣后開始程序，收集洗脫峰流出的樣，用12% SDS-PAGE跑膠鑒定后將純度高的目的蛋白用30kD超濾濃縮管濃縮保存。

1.6 用ULP1酶對融合蛋白酶切

將純化好的融合蛋白和1 μLULP1酶加入到bufferA（50 mmol/LTris-HCl，pH 8.0，1 mmol/LDTT）定容至5mL，4℃條件下靜止酶切過夜。將酶切好的蛋白溶液轉(zhuǎn)移到平衡好的Ni-NTA親和層析柱中，二次過柱收集穿出液。將穿出液用10kD超濾濃縮管濃縮保存。

2 結(jié)果與討論

2.1 FLCN二級結(jié)構(gòu)預測顯示N端多無序區(qū)域

在psipred網(wǎng)站（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred）上預測得到人源FLCN二級結(jié)構(gòu)的無序區(qū)域如圖1a所示，其中橫坐標表示FLCN一級結(jié)構(gòu)氨基酸的排列順序，縱坐標表示蛋白無序性的可信度打分，可信度高于0.5即當藍線高于灰色虛線時，對應的氨基酸被認為是無序的；橙色線顯示無序蛋白質(zhì)結(jié)合殘基預測的可信度。從圖中可以看到，F(xiàn)LCN的無序區(qū)段主要是在1-360 aa.即研究的N端，并且打分很高即可信度很高，具有很高的研究價值。

在expasy網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protscale/)上預測人源FLCN的氨基酸親疏水性的結(jié)果如圖1b所示，其中橫坐標表示FLCN一級結(jié)構(gòu)氨基酸的排列順序，縱坐標表示蛋白親疏水性的可信度打分，正值表示疏水，負值表示親水；可以看到FLCN的N端保守性區(qū)域100-230 aa.主要是正值且打分很好，說明有強疏水性即極易形成疏水性片段，推測可能作為FLCN形成聚合體或轉(zhuǎn)運結(jié)合的區(qū)域。

圖1 FLCN二級結(jié)構(gòu)預測

2.2 ppSUMO-N362重組質(zhì)粒構(gòu)建

將擴增后的N362片段插入ppSUMO載體構(gòu)建重組質(zhì)粒ppSUMO-N362，將構(gòu)建好的質(zhì)粒與ppSUMO載體進行電泳，檢查的結(jié)果如圖2所示，測序結(jié)果顯示構(gòu)建成功且無突變。

圖2 ppSUMO-N362的克隆鑒定

2.3 (His)6-SUMO-N362融合蛋白鎳柱親和純化

對表達菌進行誘導培養(yǎng)可以獲得大量融合蛋白，經(jīng)高壓破碎細胞后融合蛋白大部分可融，經(jīng)鎳柱純化時用大量的Wash Buffer漂洗后能將大部分雜蛋白洗去，洗脫的目的蛋白純度可高達70%；Western Blot檢查顯示重組蛋白成功表達并且很少降解（圖3上側(cè)）。

圖3 (His)6-SUMO-N362融合蛋白表達純化

2.4 (His)6-SUMO-N362融合蛋白離子交換后酶切

經(jīng)鎳親和純化后的融合蛋白純度不是很高，所以嘗試用HiTrap Q FF 1mL強陰離子預裝柱來純化融合蛋白，如圖4所示，當升高洗脫液的鹽濃度至300mmol/L NaCl時開始出峰，收集出峰處的洗脫液進行濃縮保存。用ULP1酶對濃縮蛋白低溫過夜酶切，可以將絕大部分的重組蛋白切開，二次過柱后穿出的濃縮樣純度可達到80%（如圖4）。

圖4 (His)6-SUMO-N362融合蛋白的分子篩純化

3 結(jié)論

本實驗利用pET28a改造而來的ppSUMO載體來構(gòu)建ppSUMO-N362重組質(zhì)粒，融合蛋白的表達量和可溶性都很高，經(jīng)鎳柱一步純化后獲得純度高達70%，使用強陰離子Q柱進行純化的效果沒有很好，接下來用ULP1酶切，可以將絕大部分的重組蛋白切開，二次過柱后穿出的濃縮樣純度達到80%，目前對于FLCN及其N端蛋白的結(jié)構(gòu)還沒有具體研究報道，純化的FLCN N端片段為后期結(jié)構(gòu)研究提供基礎(chǔ)。

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