侯立娟，林金盛，劉少華，李瑞祥，馬 林，蔣 寧，曲紹軒，李輝平

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210014；2.魯東大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺 264025)

草菇(Volvariellavolvacea)又名中國蘑菇[1]，不僅味道鮮美，營養(yǎng)豐富，還具有抗腫瘤，提高免疫力的作用，是一種食用兼藥用的名貴食用菌[2]，以草菇為原料開發(fā)的產(chǎn)品備受青睞[3]。草菇是典型的高溫型食用菌，其產(chǎn)量位居食用菌行業(yè)第8位，具有很高的經(jīng)濟價值[4]。與其他食用菌相比，草菇的生長周期較短，從營養(yǎng)生長到生殖生長形成子實體，這一周期僅需14～18 d。草菇菌絲生長的快慢及菌絲的生物量的積累對草菇子實體形成和生長有著重要影響。目前，關(guān)于草菇液體培養(yǎng)的研究多集中在生長因子[5-7]，而對如何增加草菇菌絲生物量的研究相對較少。生物量是關(guān)系到草菇產(chǎn)量的一個關(guān)鍵因素，據(jù)報道，在麥芽膏培養(yǎng)基中添加醋酸鹽可以促進雙孢蘑菇菌絲結(jié)實[8]，考慮雙孢蘑菇和草菇同屬草腐菌，此方法可以借鑒，研究不同濃度對草菇生物量的影響，結(jié)合報道的適宜濃度的礦質(zhì)元素具有促進提高金針菇[9]、灰樹花[10]、荷葉離褶傘[11]、靈芝[12]等食用菌菌絲生物量的作用。本研究通過設(shè)置不同濃度梯度的醋酸鈉及復(fù)配4種礦質(zhì)元素對草菇菌絲生物量的影響試驗分析，以期為工廠化生產(chǎn)高質(zhì)量草菇液體菌種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌種草菇V23由上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：土豆200 g(煮汁)，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，定容至1 L。

市售CPDB培養(yǎng)基：24 g定容至1 L。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的活化

草菇V23菌株斜面活化后，接種于PDA平皿上，32 ℃培養(yǎng)5 d，待菌絲長滿平板后即可用來接種。

1.3.2 不同濃度醋酸鈉液體培養(yǎng)試驗

將醋酸鈉作為生長調(diào)節(jié)劑，設(shè)計單因素實驗，篩選出最適醋酸鈉濃度。再分別采用液體培養(yǎng)的方法測定其菌絲的生物量并提取DNA確定其生物量。

先將醋酸鈉配制成母液，在市售CPDB培養(yǎng)基中分別加入0，0.1，0.3，0.5，0.7，0.9，1.1 g·L-1的醋酸鈉，共6個處理，分裝于250 mL錐形瓶內(nèi)，每瓶裝100 mL，每個處理6個重復(fù)。然后取活化后的V23草菇菌種置9 cm的平板，挖去接種點為中心向外輻射1 cm區(qū)域于均質(zhì)儀中，加入100 mL無菌水，打碎10 s，取1 mL菌種接入含100 mL PDB的250 mL三角瓶中，120 r·min-1，32 ℃培養(yǎng)5 d。

1.3.3 添加不同濃度醋酸鈉的菌絲生物量定量評價指標(biāo)DNA提取及含量測定

將3瓶菌絲收獲后分別放在-50 ℃凍干燥機中充分干燥，用于提取DNA。經(jīng)凍干的各處理的菌絲迅速研磨，各處理用精確秤取菌絲20 mg，分別裝于2 mL離心管中，采用生工Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，每個處理設(shè)置3次重復(fù)。用紫外分光光度計測定提取的DNA濃度，并確定其含量，其DNA含量作為生物量評價的定量指標(biāo)。各個濃度梯度的樣品分別稱取2、4、6、8、10 mg測定DNA濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后算出各個濃度梯度DNA的質(zhì)量。各處理的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別如下：

對照(CK)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=72.084x+140.16，R2=0.996 8；

0.1 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=48.543x+9.4967，R2=0.997 4；

0.3 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=29.915x+36.363，R2=0.999 0；

0.5 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=18.85x+73.867，R2=0.997 3；

0.7 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=15.338x-0.4433，R2=0.990 8；

0.9 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=18.27x-10.447，R2=0.993 7；

1.1 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=12.485x+59.503，R2=0.991 1。

1.3.4 醋酸鈉復(fù)配4種微量元素對草菇菌絲生物量的影響

選擇4種微量元素(Zn、Cu、K、Mn)，設(shè)置不同的濃度梯度如下：ZnSO4(0.10、0.15、0.20、0.25 g·L-1)，KH2PO4(3、4、5、6、7、8 g·L-1)，MnSO4(0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 g·L-1)，CuSO4(0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 g·L-1)，在最適醋酸鈉濃度為0.7 g·L-1的基礎(chǔ)上篩選醋酸鈉復(fù)配不同濃度梯度的微量元素，來比較對草菇菌絲生物量的影響。不同微量元素添加到草菇液體培養(yǎng)基中的操作方法參考1.3.2節(jié)，醋酸鈉復(fù)配4種微量元素濃度的生物量采用測定其DNA含量來評價，具體方法參考1.3.3節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)處理，利用DPS統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行顯著分析處理，大寫字母代表顯著水平P<0.01，小寫字母代表顯著水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度醋酸鈉對草菇菌絲生物量的影響

不同濃度的醋酸鈉對草菇菌絲生物量的影響以液體培養(yǎng)5 d后的菌絲定量提取DNA含量為評價指標(biāo)，結(jié)果顯示，隨著醋酸鈉含量的增加，其菌絲的DNA含量呈線性增加，當(dāng)增加到一個最高點，即醋酸鈉含量添加為0.7 g·L-1時，菌絲所含有的DNA含量最高，分別比CK、0.1 g·L-1、0.3 g·L-1、0.5 g·L-1處理增加51.62%、23.41%、19.66%、10.24%，隨著醋酸鈉含量達到0.9 g·L-1、1.1 g·L-1時，DNA含量逐漸下降，雖然分別比0.7 g·L-1處理減少19.45%和21.06%，但是也分別比CK的DNA含量高22.12%和19.66%。由此說明采用醋酸鈉處理后，菌絲DNA含量的影響是隨著醋酸鈉含量的增加呈線性增加，當(dāng)達到最高值后，又呈減少趨勢，各處理的DNA含量極顯著高于CK。說明適量添加醋酸鈉能夠促進菌絲的生物量的增加。

2.2 醋酸鈉復(fù)配4種微量元素對草菇菌絲生物量的影響

2.2.1 醋酸鈉復(fù)配不同濃度的CuSO4對草菇菌絲生物量的影響

在篩選出適宜的醋酸鈉濃度為0.7 g·L-1的基礎(chǔ)上，復(fù)配CuSO4的不同濃度對菌絲生物量的影響見圖1- A。實驗結(jié)果表明，隨著CuSO4濃度的增加，對菌絲的DNA 含量影響呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)CuSO4濃度增加到0.04 g·L-1時，其菌絲DNA含量最高，之后，再隨著CuSO4濃度的增加，菌絲DNA 含量反而呈減少趨勢。與CK比，添加0.04 g·L-1的CuSO4時，草菇菌絲生物量達到顯著水平(P<0.05)，其DNA濃度為871.43 μg·mg-1，比CK(DNA為503.16 μg·mg-1)增加368.27 μg·mg-1，提高73.19%；添加CuSO4的濃度分別為0.06 g·L-1、0.08 g·L-1時，菌絲DNA 含量比CK提高16.47%和31.47%；濃度為0.1 g·L-1和0.12 g·L-1的CuSO4其菌絲的DNA含量減少8.85%和30.19%，但CK與添加CuSO4濃度為0.06 g·L-1、0.08 g·L-1、0.10 g·L-1和0.12 g·L-1處理之間菌絲生物量不存在顯著性差異。

表1不同濃度醋酸鈉處理對草菇菌絲DNA含量的影響

Table1Effect of different concentrations of sodium acetate on mycelium DNA content ofV.volvacea

處理Treatment/(g·L-1)菌絲DNA含量/(μg·g-1)MyceliumDNAcontent/(μg·g-1)顯著性分析Significantanalysis(P<0.01)02.39±0.10G0.17.48±0.29F0.311.46±0.21E0.518.32±0.89D0.731.42±0.83A0.921.46±0.21C1.125.31±0.44B

不同處理間沒有相同大寫或小寫字母表示差異極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)。The bars with different uppercase or lowercase letters showed the significance at the level of 0.05 or 0.01.圖1 不同濃度的微量元素對草菇菌絲DNA含量的影響Fig.1 Effect of different concentrations of microelements on mycelium DNA content

2.2.2 醋酸鈉復(fù)配不同濃度的KH2PO4對草菇菌絲生物量的影響

復(fù)配不同濃度KH2PO4試驗結(jié)果見圖1- B。與CK比，各處理均能提高菌絲DNA 含量，其中，當(dāng)KH2PO4達8.0 g·L-1時對草菇菌絲的生長影響最好，其DNA 含量(927.47 μg·mg-1)高于其他各處理，比對照(DNA含量503.16 μg·mg-1)顯著提高84.32%(P<0.05)；濃度為5.0 g·L-1的KH2PO4對草菇菌絲的生長影響次之，比對照增加70.98%；除CK 外，其他各處理之間的DNA含量無顯著差異。濃度為4.0 g·L-1和6.0 g·L-1的KH2PO4對草菇菌絲的生物量的影響不大。

2.2.3 醋酸鈉復(fù)配不同濃度的MnSO4對草菇菌絲生物量的影響

復(fù)配不同濃度的MnSO4對草菇菌絲的生長影響見圖1- C。不同濃度MnSO4對菌絲生長的影響不同。當(dāng)MnSO4濃度為0.35 g·L-1時，菌絲的生物量最大，當(dāng)MnSO4濃度為0.20 g·L-1時，菌絲的生物量最小，并極顯著高于濃度為0.20 g·L-1(P<0.01)，雖然0.35 g·L-1的MnSO4(630.07 μg·mg-1)，比對照CK(503.16μg·mg-1)提高25.22%；濃度為0.20 g·L-1的MnSO4(218.47 μg·mg-1)比CK減少56.58%，MnSO4的各處理之間與CK相比，不存在差異顯著性。

2.2.4 醋酸鈉復(fù)配不同濃度的ZnSO4對草菇菌絲生物量的影響

醋酸鈉復(fù)配添加ZnSO4對菌絲生物量的影響(圖1- D)表明，適宜的ZnSO4濃度能顯著促進草菇菌絲的生物量，按照對菌絲生物量的影響從高到低，ZnSO4的添加量依次為：0.25 g·L-1>0.20 g·L-1>CK>0.10 g·L-1>L 0.15 g·L-1。濃度為0.25 g·L-1的ZnSO4對草菇菌絲的生物量積累最大，其DNA含量為718 μg·mg-1，比CK的(DNA含量503.16 μg·mg-1)提高42.69%；濃度為0.20 g·L-1的ZnSO4對草菇菌絲的生長影響次之，比對照CK的DNA含量提高20.34%；ZnSO4添加量為0.25 g·L-1與0.15 g·L-1之間的菌絲生物量達到1%極顯著水平；0.25 g·L-1和0.10 g·L-1達到5%顯著水平，0.25 g·L-1、0.20 g·L-1與CK 之間不存在顯著差異。

3 討論

本實驗在液體培養(yǎng)條件、接種條件一致的情況下，研究醋酸鈉在不同梯度濃度下液體培養(yǎng)對草菇菌絲生物量的影響，借鑒余昌霞等[13-14]報道的DNA含量為指標(biāo)檢測液體培養(yǎng)中相對生物量的方法。根據(jù)前者的研究報道，同等液體培養(yǎng)條件下的菌絲生物量和單位干重菌絲中DNA含量均受到培養(yǎng)基質(zhì)細微變化的影響[13]。因此，液體培養(yǎng)參考余昌霞等[13]研究所用的市售的CPDB培養(yǎng)基，成分穩(wěn)定；DNA含量測定是定量秤取每個處理研磨好的菌絲粉末，使人為誤差降到最低。從測定對菌絲DNA含量作為生物量的影響指標(biāo)看，醋酸鈉添加后都極顯著地提高了菌絲生物量，對菌絲生物量影響的趨勢表現(xiàn)為，生物量隨著醋酸鈉濃度的增加呈線性增加的趨勢，當(dāng)達到0.7 g·L-1時，生物量達到一個高峰值，測得菌絲的DNA含量為468.9±4.10 μg·g-1，極顯著地高于CK，當(dāng)醋酸鈉濃度繼續(xù)增加為0.9 g·L-1和1.1 g·L-1，測得生物量均呈減少的趨勢，但仍比CK的生物量高。說明醋酸鈉添加后能極顯著地增加草菇的生物量的穩(wěn)定性。為了使菌絲的生物量最大化，進一步在篩選出最適醋酸鈉濃度(0.7 g·L-1)基礎(chǔ)上復(fù)配Cu、Zn、K、Mn元素，以添加醋酸鈉為對照，進一步篩選對草菇菌絲生長有促進作用的適宜礦物質(zhì)元素和最佳濃度，實驗結(jié)果顯示，復(fù)配礦物質(zhì)元素適宜濃度對草菇菌絲生物量有促進作用，濃度過高或者過低反而抑制草菇菌絲的生長。其中，添加礦物質(zhì)K元素和Cu元素效果較好，各濃度均能比CK菌絲的生物量有所增加，其中添加KH2PO4為8 g·L-1比CK加菌絲的生物量增加84.32%，達到5%顯著水平；CuSO4為0.04 g·L-1時比CK的菌絲生物量增加了73.19%，達到5%顯著水平。已報道適量的銅可以促進多種食用菌菌絲體的生長，例如，在平菇[15-16]、金針菇[17]、亞側(cè)耳[18]、大球蓋菇[19]、杏鮑菇[20，21]、白靈菇[22]、松茸[23]中發(fā)現(xiàn)，適量的銅可以使菌絲生長加快，菌絲粗壯、潔白，提前成熟，產(chǎn)量和生物學(xué)效率提高，這些結(jié)果與本研究的試驗結(jié)果相似，說明適量的Cu元素可以促進菌絲的生長和菌絲體生物量的顯著增加。據(jù)盧嬌嬌[24]報道，白靈菇的PDA 平板培養(yǎng)基中添加不同銅濃度，100～250 μmol·L-1能促進平菇菌絲生長，菌絲潔白、長勢旺、菌落邊緣整齊；1 000 μmol·L-1時，能顯著抑制平菇菌絲生長，且菌絲稀疏，朝一邊生長；液體培養(yǎng)基中添加 250～500 μmol·L-1銅能增加菌絲干質(zhì)量，1 000 μmol·L-1的銅時，能明顯降低平菇菌絲干質(zhì)量。結(jié)果說明即使是同一品種的食用菌添加量不同，Cu元素對固體培養(yǎng)條件下菌絲生長的影響和液體培養(yǎng)條件下菌絲干質(zhì)量的影響也是不同的。同時，Cu元素對食用菌生長發(fā)育的影響，也存在種類差異。謝必峰等[25]報道了 Cu 元素對香菇產(chǎn)量存在明顯的抑制作用，而對鳳尾菇卻有增產(chǎn)效應(yīng)。Beelman等[26]研究表明Cu的積累可以增加雙孢蘑菇的產(chǎn)量和質(zhì)量。

在添加1 g·L-1KH2PO4時，杏鮑菇菌絲生長的促進作用最明顯，與對照差異顯著[27]。龔鳳萍[28]報道，在培養(yǎng)基中添加一定濃度的鉀，能促進平菇菌絲生長，菌絲濃白、菌落邊緣整齊；在液體培養(yǎng)基中添加的鉀，平菇菌絲生物量明顯提高；在棉籽殼中添加的鉀，平菇菌絲長速變化不大，但菌絲長勢變好，栽培生物學(xué)效率提高。磷酸二氫鉀對楊樹菇菌絲體生長有明顯的促進作用， 培養(yǎng)基含有磷酸二氫鉀時的菌絲最高生長量要比不含磷酸二氫鉀的高出0.122 g·100 m-1[29]。在磷酸二氫鉀(KH2PO4)對香菇生長量影響的試驗中，在液體養(yǎng)條件下，KH2PO4濃度為0.05%， 發(fā)酵96 h，香菇生長量最大[30]，與本實驗的研究結(jié)果相同。

據(jù)報道，Zn是金針菇生長的必需元素，在4 mg·kg-1以內(nèi)明顯促進金針菇菌絲生長，超過5 mg·kg-1生長量下降，到6 mg·kg-1時表現(xiàn)出對金針菇菌絲體的抑制效果[31]，雞腿菇栽培種，培養(yǎng)基中添加400 mg·L-1的Zn，能促進菌絲體的生長[32]。硫酸鋅、硫酸銅分別為3 mg·kg-1，200 mg·kg-1時，能促進香菇菌絲的生長[33]。張長青等[34]認(rèn)為，在添加后，白靈側(cè)耳菌絲萌發(fā)早，菌絲生長快，且較濃密健壯。本實驗的結(jié)果顯示，適當(dāng)濃度的MnSO4和ZnSO4對菌絲生物量有促進作用，但與CK相比無顯著差異。主要原因分析，一是可能由于栽培品種的差異，對銅元素吸收利用能力不同；二是由于設(shè)置的濃度梯度不同造成的。

建立定量指標(biāo)來衡量菌絲生長發(fā)育的情況，揭示生長現(xiàn)象與其生理代謝的關(guān)系成為學(xué)者關(guān)注熱點[35-40]。本實驗從單一變量研究醋酸鈉不同梯度濃度對草菇菌絲生長的影響，有助于了解有關(guān)添加醋酸鈉能增加草菇生物量的原因，其原因可能是添加醋酸鈉后，使培養(yǎng)基質(zhì)的pH值更有利于草菇菌絲的生長，草菇生長喜歡堿性條件；也有可能是添加醋酸鈉后補充了微量元素，或提供了能量物質(zhì)或營養(yǎng)物質(zhì)供草菇菌絲生長利用，其促進生物量的作用機理有待于進一步研究證明。本研究結(jié)果可以為工廠化草菇液體菌種生產(chǎn)提供參考。

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