陳思祎

摘 要 從固相萃取柱、 上樣樣品pH值、 洗脫液、 定容液四方面優(yōu)化前處理流程，建立了地表水中喹諾酮類、 磺胺類、 四環(huán)素類、 大環(huán)內(nèi)酯類、 青霉素類、 頭孢菌素類以及氨基糖苷類7類共49種抗生素的質(zhì)譜指紋的提取方法。水樣采用MAXHLB 串聯(lián)柱富集凈化，在超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS /MS）的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下進(jìn)行定性及定量分析。結(jié)果表明，各抗生素在0.001～0.5 μg/mL （鏈霉素為0.01～5 μg/mL）濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，各目標(biāo)抗生素的加標(biāo)回收率為51.7%～94.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%～9.7%。 以3倍和10倍信噪比確定目標(biāo)抗生素在兩種定容液中的檢出限以及定量限分別為0.01～3.23 μg/L和0.05～3.43 μg/L以及0.04～10.8 μg/L和0.17～11.4 μg/L。應(yīng)用此方法對(duì)秦淮河和玄武湖的9個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了抗生素污染篩查。

關(guān)鍵詞 固相萃??； 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 抗生素； 地表水

1 引 言

近年來(lái)，抗生素水環(huán)境污染事件頻發(fā) [1]，引起環(huán)保部門以及社會(huì)各界的關(guān)注與重視，而抗生素全國(guó)使用量與排放量清單進(jìn)一步揭示了我國(guó)抗生素的使用及污染現(xiàn)狀[2]。目前已在我國(guó)多個(gè)水系的水體中檢測(cè)到抗生素的存在[3]，濃度在ng/L～μg/L范圍[1]。

在實(shí)際的地表水抗生素污染監(jiān)控工作中，樣品量巨大，污染對(duì)象也具有很大的不明確性，因此開發(fā)快速、 操作簡(jiǎn)便以及涵蓋種類更廣泛的抗生素質(zhì)譜指紋提取方法將大大提高環(huán)保部門對(duì)水環(huán)境抗生素污染定位的能力，可及早發(fā)現(xiàn)污染、 追溯污染、 防止進(jìn)一步造成嚴(yán)重的環(huán)境危害。所謂指紋，是指能夠全面滿足污染物證分析溯源需要的特征物質(zhì)信息體系，該體系既要能夠多層面廣尺度展現(xiàn)污染源不同特性及其排它差異，又要能夠通過(guò)靈敏快捷、 客觀可靠的現(xiàn)代儀器聯(lián)用技術(shù)測(cè)定[4]，而抗生素質(zhì)譜指紋則是指通過(guò)質(zhì)譜手段去獲取的水環(huán)境抗生素信息。目前已有許多文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)質(zhì)譜手段同時(shí)檢測(cè)多種抗生素的方法[5～8]。徐暉等[9]報(bào)道了一種檢測(cè)河流水體中痕量的5類 12 種抗生素殘留的固相萃取液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（SPELCMS/MS）方法，并應(yīng)用該方法分析了河水中的抗生素殘留； Julia等[10]開發(fā)了一種能夠長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)城市污水中醫(yī)用抗生素的固相萃取液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（SPELCMS/MS）快速分析方法，該方法可以檢測(cè)不同種類共18種抗生素。然而抗生素質(zhì)譜指紋提取的主要目的是能夠簡(jiǎn)便高效地提取多層面廣尺度的抗生素信息，關(guān)鍵在于檢測(cè)目標(biāo)物的全面性。但是上述方法涵蓋的抗生素種類有限，并且難以同時(shí)對(duì)一些理化性質(zhì)差別巨大的不同類別抗生素進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)法滿足通過(guò)一次提取就能獲得抗生素質(zhì)譜指紋信息的需求。

本研究從固相萃取柱的選擇、 上樣樣品pH值、 洗脫液、 定容液四方面對(duì)前處理流程的進(jìn)行優(yōu)化，建立了同時(shí)檢測(cè)地表水中喹諾酮類（Quinolones， QLs）、 磺胺類（Sulfonamides， SAs）、 四環(huán)素類（Tetracyclines， TCs）、 大環(huán)內(nèi)酯類（Macrolides， MLs）、 青霉素類（Penicillins， PENs）、 頭孢菌素類（Cephalosporins， CEPs）以及鏈霉素（Streptomycin， STR）7類共49種抗生素指紋的固相萃取超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（SPEUPLCMS/MS）的分析測(cè)定方法。應(yīng)用本方法對(duì)秦淮河和玄武湖共9個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行抗生素污染篩查，定位地表水抗生素污染嚴(yán)重的異常位點(diǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司），配Agilent ECC18色譜柱（75 mm×2.1 mm， 2.7 μm）； SCIEX QTRAP 4500串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB公司）； AG285電子天平（瑞士Mettler公司）； MG2200氮吹儀（日本EYELA公司）； WH3微型旋渦混合儀（上海楚定分析儀器有限公司）； MilliQ超純水儀（美國(guó)Millipore公司）； 12通道固相萃取裝置（美國(guó)Supelclean公司）。Waters Oasis WCX固相萃取柱（150 mg，6 mL）、 Waters Oasis HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL）、 Waters Oasis MAX固相萃取柱（60 mg，3 mL，30 μm）購(gòu)于美國(guó)Waters公司； CNW BOND SAX（200 mg，6mL，安譜公司）。

抗生素（如表1所示）標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司?？股貎?nèi)標(biāo)均購(gòu)自加拿大Toronto Research Chemicals公司。乙腈、 甲醇和甲酸（色譜純，德國(guó)Merck公司）； 乙二胺四乙酸二鈉 （Na2EDTA·2H2O ）、 NaOH（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）。

將目標(biāo)抗生素的標(biāo)準(zhǔn)品分別制成 1000 mg /L 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。其中，青霉素類抗生素用乙腈水（1∶1，V/V）配制，磺胺嘧啶和四種喹諾酮類抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用1% （V/V）氨水甲醇配制，鏈霉素用20%（V/V）甲醇水溶液配制，其余目標(biāo)抗生素用甲醇配制。

紅霉素在酸性條件下會(huì)發(fā)生降解，實(shí)驗(yàn)中通過(guò)檢測(cè)去水紅霉素來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)紅霉素的監(jiān)測(cè)。去水紅霉素的配制方法：以30%甲醇溶液配制100 mg/L紅霉素，用3 mol/L H2SO4調(diào)至pH 3，在室溫下連續(xù)攪動(dòng)3 h，使紅霉素能完全轉(zhuǎn)變?yōu)槿ニt霉素[11]。

2.2 樣品的采集與保存

參照水質(zhì)河流采樣指導(dǎo)[12]，使用采水器采集采樣點(diǎn)水面下0.5 m處的水樣，每個(gè)采樣點(diǎn)采集1 L的水樣，采集到的水樣用0.45 μm孔徑的濾膜過(guò)濾后， 于4℃避光儲(chǔ)存，并于一周內(nèi)分析檢測(cè)。endprint

2.3 樣品前處理

取經(jīng)過(guò)濾的水樣1 L，加入0.8 g Na2EDTA和20 μL 內(nèi)標(biāo)（10 μg/mL的四環(huán)素d6、 磺胺二甲嘧啶d6），用8 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH 11。固相萃取柱HLB和MAX分別用6 mL甲醇、 6 mL超純水以及6 mL pH=11的超純水活化。將兩種固相萃取柱以MAX在上、 HLB在下的形式串聯(lián)在一起，上樣時(shí)水樣先通過(guò)MAX柱再通過(guò)HLB柱。上樣結(jié)束后，用6 mL 5%（V/V）氨水溶液淋洗MAX柱，用6 mL超純水淋洗HLB柱，干燥。

MAX柱先用4.5 mL的溶液Ⅰ（甲酸（pH=3）甲醇（1∶9， V/V））溶液洗脫，并定容至5 mL，渦旋混合后過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜，置于進(jìn)樣小瓶中，待分析檢測(cè)。再用3 mL的甲醇和4 mL的2%甲酸甲醇溶液對(duì)MAX柱進(jìn)行洗脫，洗脫液置于20 mL具塞比色管中。HLB柱用6 mL甲醇分3次洗脫，洗脫液置于同一比色管中。洗脫液在40℃下氮吹至完全干燥，用溶液Ⅱ（乙腈水（1∶9， V/V））定容至2 mL，渦旋2～3 min，18000 r/min離心10 min。取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜，取其中1 mL加入甲酸至甲酸含量為0.2%，余下部分不添加甲酸，兩份溶液待測(cè)。樣品前處理流程如圖1所示。

2.4 UPLCMS/MS條件

2.4.1 UPLC測(cè)定條件 柱溫： 30℃， 流動(dòng)相： 0.2%（V/V）甲酸/水（A）和乙腈（B），流速0.4 mL/min； 梯度洗脫程序： 0～7.00 min， 90%～60% A； 7.00～10.00 min， 60%～40% A； 10.00～10.01 min， 40%～90% A； 10.01～11.50 min， 90% A。

2.4.2 MS/MS條件 采用電噴霧離子源正電離模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。氣簾氣（Curtain gas，CUR）壓力為35.0 kPa，噴霧氣（Ion source gas 1，GS1）壓力為55.0 kPa，輔助加熱氣（Ion source gas 2，GS2）壓力為60.0 kPa，源溫度（Temperature，TEM）為450.0℃，離子化電壓（Ionspray Voltage， IS）為4500 V，碰撞氣（Collision gas，CAD）參數(shù)為 Medium。其它參數(shù)如表1所示。

2.5 分析方法的質(zhì)量控制

為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，實(shí)驗(yàn)中采用全程空白、 平行樣及內(nèi)標(biāo)對(duì)分析過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量控制，并采用標(biāo)準(zhǔn)添加法以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。本研究中，磺胺類抗生素以磺胺二甲嘧啶d6（SMTd6） 內(nèi)標(biāo)定量，四環(huán)素類抗生素以四環(huán)素d6（TCd6）內(nèi)標(biāo)定量； 其余抗生素，保留時(shí)間在2.5 min之前的以磺胺二甲嘧啶d6（SMTd6） 內(nèi)標(biāo)定量，在2.5 min后的以四環(huán)素d6（TCd6）內(nèi)標(biāo)定量。分別將2.3節(jié)中得到的3種水樣提取液平均分成兩份，一份直接進(jìn)樣分析，記錄待測(cè)樣品和內(nèi)標(biāo)的峰面積； 另一份根據(jù)第一份的檢出情況，精密加入適量各目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，然后進(jìn)樣分析，記錄待測(cè)樣品和內(nèi)標(biāo)的峰面積。依據(jù)如下的標(biāo)準(zhǔn)添加法校正公式計(jì)算樣品濃度：

C=SRxRs-Rx（1）

其中，C為校正后的濃度； S為標(biāo)準(zhǔn)添加量； RX為標(biāo)準(zhǔn)液添加前測(cè)得待測(cè)樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值； RS為標(biāo)準(zhǔn)液添加后測(cè)得待測(cè)樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值[13]。

3 結(jié)果與討論

3.1 固相萃取柱的選擇與串聯(lián)

抗生素的凈化富集多采用固相萃取的方法。比較了5種不同類型的固相萃取柱（反相吸附型HLB柱、 混合型陰離子交換型MAX柱、 混合型陽(yáng)離子交換型MCX柱、 弱陽(yáng)離子交換型WCX柱、 強(qiáng)陰離子交換型SAX柱）對(duì)目標(biāo)抗生素的吸附效果（圖2）。結(jié)果表明，大多數(shù)抗生素在使用MAX柱萃取時(shí)效果較好，回收率在60.2%～101.4%之間，但對(duì)磺胺類抗生素的富集效果不佳，這可能由于MAX柱一般在堿性條件下使用，此時(shí)兩性的抗生素分子的羧基或者酚羥基等失去氫離子形成的陰離子可以與填料上的季銨陽(yáng)離子結(jié)合，而磺胺類抗生素分子沒(méi)有類似結(jié)構(gòu)。相反，在酸性條件下使用MCX柱時(shí)，磺胺類抗生素結(jié)構(gòu)中的氨基結(jié)合氫離子，形成陽(yáng)離子，可與填料上的磺酸基陰離子結(jié)合，達(dá)到較好的富集效果。但MCX柱對(duì)喹諾酮類、 四環(huán)素類及鏈霉素3類抗生素富集效果極差，回收率低于40%。磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物通過(guò)分子間作用力在HLB柱上有較好的富集效果。因此，考慮將MAX與HLB柱串聯(lián)使用。

3.2 固相萃取的上樣條件選擇

HLB柱通常在酸性條件下使用，而MAX柱則多在堿性條件下上樣，兩者串聯(lián)使用時(shí)需要將上樣條件統(tǒng)一。綜合考慮HLB柱和MAX柱的上樣條件，選擇MAX柱上樣pH=3～4，HLB柱上樣pH=8～9進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

上樣時(shí)的pH值與水樣中抗生素的電離情況密切相關(guān)，在酸性上樣條件下，兩性分子多以陽(yáng)離子的形式存在，在MAX柱上難以發(fā)生陰離子交換，因此對(duì)大多數(shù)的抗生素的萃取效果都不理想（圖3），回收率均在20%以下。而HLB柱主要的作用原理是反相吸附，pH值對(duì)其的影響小于MAX柱，實(shí)驗(yàn)得到的回收率也相對(duì)較好，喹諾酮類、 大環(huán)內(nèi)酯類及青霉素類的回收率在53.9%～81.1%，而回收率較低的磺胺類、 四環(huán)素類等目標(biāo)物在兩種柱子串聯(lián)使用時(shí)回收率為52.2%～75.5%。綜上，選擇在堿性上樣的條件下將MAX柱與HLB柱串聯(lián)使用。

3.3 洗脫條件的選擇

由于各類抗生素之間有較大的性質(zhì)差異，單純使用有機(jī)溶劑洗脫可能得不到較好的洗脫效果，實(shí)驗(yàn)中分別使用水系及有機(jī)系洗脫液對(duì)HLB和MAX柱進(jìn)行洗脫（圖4）。其中，水系洗脫液A（Eluent A）為甲酸（pH=3）甲醇（9∶1， V/V）混合溶液； 有機(jī)系洗脫液B（Eluent B）為甲醇（HLBB）及甲醇和甲酸甲醇（2∶98， V/V）（MAXB）。endprint

結(jié)果表明，磺胺類、 四環(huán)素類、 大環(huán)內(nèi)酯類和青霉素類抗生素在HLB和MAX柱使用有機(jī)系的洗脫液時(shí)有較好的洗脫效果，喹諾酮和頭孢類則在HLB柱使用有機(jī)系洗脫液洗脫時(shí)效果較好。MAX柱使用水系洗脫劑洗脫時(shí)相比HLB柱有較好的效果。鏈霉素在對(duì)兩種柱子使用水系洗脫液時(shí)有較好的洗脫效果，并且MAX 柱的回收率（41.6%）大于HLB柱（15.6%）。綜合考慮上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用對(duì)HLB柱使用甲醇洗脫，MAX柱用兩種洗脫液分別洗脫以獲得最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.4 定容液的比較

氮吹后使用定容液對(duì)殘留物進(jìn)行溶解定容，比較了兩種定容液對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

定容液A （Redissolve solution A）為乙腈0.2%甲酸溶液（1∶1， V/V）； 定容液B（Redissolve solution B）為乙腈0.2%甲酸溶液（1∶9， V/V）。結(jié)果如圖5所示，使用定容液B的效果要優(yōu)于A，尤其是四環(huán)素類抗生素，回收率明顯增加。這是由于與定容液A相比，B的有機(jī)相比例較低，溶劑的極性較大，對(duì)一些極性較大的目標(biāo)抗生素的溶解能力有所增加。

但是使用定容液B時(shí)也發(fā)現(xiàn)，青霉素類抗生素容易在檢測(cè)譜圖中出現(xiàn)雙峰，不利于定量計(jì)算。這是由于青霉素類抗生素在酸性溶液中不穩(wěn)定，易發(fā)生水解，生成青霉噻唑酸，例如芐青霉素（青霉素G）酸性條件下會(huì)發(fā)生降解，而 pH=5～9 時(shí)較為穩(wěn)定[15]。采用定容液乙腈水（1∶9， V/V）時(shí)可以使譜圖呈現(xiàn)單峰，故選擇乙腈水（1∶9， V/V）作為定容液。將得到的樣品分為兩份，一部分以乙腈水（1∶9， V/V）作為定容液，檢測(cè)青霉素； 另一部分以乙腈02%甲酸（1∶9， V/V）為定容液，檢測(cè)其它抗生素。

3.5 方法學(xué)確證

3.5.1 線性范圍及檢出限 用各目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制系列濃度梯度（0.001～0.500 μg/mL，鏈霉素為0.01～5.00 μg/mL）的溶液，在上述UPLCMS/MS條件下進(jìn)行檢測(cè)，分別以3和10倍信噪比確定檢出限和定量限（表2）。各目標(biāo)物在此濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）在0.9775～0.9994之間。

3.5.2 加標(biāo)回收率 使用空白水樣在兩個(gè)添加水平（10和2 μg/L，鏈霉素為100和20 μg/L）下進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，各目標(biāo)抗生素的在兩個(gè)濃度下的加標(biāo)回收率為51.7%～94.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.2%～9.7%（表2）。目標(biāo)物的質(zhì)譜指紋圖譜如圖6所示。

3.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用上述方法測(cè)定秦淮河（Q1～Q5）和玄武湖（X1～X4）的9個(gè)水樣，檢測(cè)結(jié)果如表3所示，樣品中共檢出15種抗生素，包括喹諾酮類、 磺胺類、 四環(huán)素類、 大環(huán)內(nèi)酯類以及頭孢類5類，抗生素含量分別為0.3～250.8 ng/L和1.3～210.2 ng/L。

其中，四環(huán)素類抗生素檢出濃度最高，為70.6～250.8 ng/L，與Zou等[16]報(bào)道的檢出濃度相近。四環(huán)素類抗生素多用于畜禽養(yǎng)殖。Zhang等[2]的調(diào)查研究顯示，2013年在4種四環(huán)素類抗生素用量中，人用占24.8%，獸用占75.2%。四環(huán)素類抗生素也是江蘇養(yǎng)殖場(chǎng)的常用藥物，在動(dòng)物糞便中有高的檢出濃度和檢出率[17]。因此，畜禽養(yǎng)殖污染可能是水樣中四環(huán)素類抗生素的重要來(lái)源之一。

檢出率較高的抗生素有林可霉素、 克林霉素、 紅霉素以及頭孢拉定，這4種抗生素最大濃度在25.3～0.3 ng/L之間。抗生素的高檢出率可能與其使用量高或者生物降解性低等因素有關(guān)。頭孢類抗生素是國(guó)內(nèi)外臨床應(yīng)用最多的一類抗感染藥物[18]，紅霉素在養(yǎng)殖業(yè)以及疾病治療中也有廣泛應(yīng)用。而林可霉素和克林霉素則由于具有胺、 環(huán)結(jié)構(gòu)，脂族醚和硫結(jié)構(gòu)，生物降解性低[19]，易殘留在環(huán)境中。

Q3和X4位點(diǎn)的抗生素污染情況與其它位點(diǎn)有明顯的差異，超過(guò)10種抗生素被檢出，檢出濃度高達(dá)540.8和412.7 ng/L。這一情況可能與位點(diǎn)附近存在抗生素的污染源有關(guān)，也可能與采樣前的排污行為有關(guān)，因此需要對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行密切監(jiān)控。

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Abstract An extract method for the fingerprint feature of 49 kinds of antibiotics belonging to multiple classes in surface water was developed. Water sample was purified and concentrated by tandem dual column （MAX and HLB）， and qualitatively and quantitatively analyzed by ultrahigh performance liquid chromatographytandem mass spectrometric （SPEUPLCMS/MS） under multiple reaction monitoring （MRM） mode. The pretreatment was optimized in types of SPE column， loading pH， eluent and redissolution for multiclass antibiotics. The results showed that the linearity of target antibiotics was good in the range of 0.001-0.5 μg/mL （0.01-5 μg/mL for streptomycin）. The recoveries were from 51.7% to 94.8%， and the relative standard deviations （RSDs） ranged from 2.19% to 9.67%. The limits of detection （LOD， S/N=3） were 0.01-3.23 μg/L and 0.05-3.43 μg/L and the limits of quantification （LOQ， S/N=10） were 0.04-10.8 μg/L and 0.17-11.4 μg/L in different redissolve solutions. This method was applied to the determination of antibiotics in water samples from 9 sites of Qinhuai River and Xuanwu Lake.

Keywords Solid phase extraction； Ultra high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Antibiotic； Surface water

（Received 11 May 2017； accepted 1 November 2017）endprint