孫蓓麗 王玉剛

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院消化內(nèi)科(200336)

胃癌是常見(jiàn)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害居民健康和增加政府財(cái)政負(fù)擔(dān)。2012年中國(guó)胃癌新發(fā)病例數(shù)和男性發(fā)病率位居同期惡性腫瘤第2位，死亡率位居第3位；女性胃癌發(fā)病率位居同期惡性腫瘤第4位，死亡率位居第2位[1]。胃癌預(yù)后與分期相關(guān)，然而目前早期胃癌診斷率低，大部分胃癌在確診時(shí)已是進(jìn)展期，預(yù)后不良。因此，早診斷、早治療是提高胃癌患者生存率的重要手段。目前胃鏡檢查是診斷胃癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但因其屬侵入性檢查、費(fèi)用較高等缺點(diǎn)，難以用于我國(guó)胃癌的大規(guī)模篩查。亟待探尋一種方便、精準(zhǔn)、無(wú)創(chuàng)的檢查用于胃癌的篩查和診斷。外泌體是一種由多種細(xì)胞分泌的具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的納米級(jí)囊泡，含有蛋白質(zhì)、核酸等生物活性物質(zhì)，通過(guò)傳遞其內(nèi)容物給受體細(xì)胞，參與多種生理病理過(guò)程。近年來(lái)，諸多研究發(fā)現(xiàn)外泌體在包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。本文就外泌體與胃癌相關(guān)性的研究進(jìn)展作一綜述。

一、外泌體的生物學(xué)特性

1.外泌體的概述：Johnstone等[2]最早發(fā)現(xiàn)綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟過(guò)程中會(huì)以囊泡形式丟失大量細(xì)胞膜蛋白，后將該種囊泡命名為“外泌體”，起初外泌體僅被認(rèn)為是細(xì)胞排泄廢物的一種方式。目前外泌體特指由脂質(zhì)雙分子層構(gòu)成的直徑在40～100 nm，密度為1.13～1.19 g/mL的小囊泡[3]。內(nèi)體膜內(nèi)吞形成細(xì)胞內(nèi)多囊泡體(multi-vesicular bodies,MVBs)，后者與質(zhì)膜融合后，向胞外釋放多個(gè)腔內(nèi)囊泡(intraluminal vesicles,ILVs)，這些被釋放入細(xì)胞外環(huán)境的ILVs即為外泌體[4-5]。除網(wǎng)織紅細(xì)胞以及T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等非血源性細(xì)胞外，其余細(xì)胞均能分泌外泌體，外泌體幾乎存在于人體所有體液中。

2.外泌體的構(gòu)成：外泌體具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，富含膽固醇和鞘磷脂，其內(nèi)容物有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸。外泌體的蛋白質(zhì)成分復(fù)雜，分為非特異性蛋白和特異性蛋白兩類。前者包括細(xì)胞骨架蛋白、四跨膜蛋白(CD63、CD81、CD9等)、多泡體生成相關(guān)蛋白(Alix、TSG101等)、細(xì)胞膜融合和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白(Rabs蛋白、聯(lián)膜蛋白)、熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)、整合素等黏附分子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，其中CD63、CD81、Alix、TSG101等可作為外泌體的標(biāo)記蛋白。后者與細(xì)胞來(lái)源相關(guān)，如結(jié)腸上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體含有多種代謝酶和腸組織特異性抗原；樹(shù)突細(xì)胞來(lái)源的外泌體含有主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ、CD86，與T淋巴細(xì)胞活化密切相關(guān)；腫瘤來(lái)源的外泌體通常含有腫瘤抗原和死亡誘導(dǎo)因子配體、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)等免疫抑制蛋白[6]。2007年Valadi等[7]首次在外泌體中發(fā)現(xiàn)了信使 RNA(mRNAs)、微RNA(miRNAs)等核酸類物質(zhì)，具有生物活性，提示外泌體可能作為遺傳信息的載體參與細(xì)胞間遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和表達(dá)。

3.外泌體的生物學(xué)功能：外泌體可通過(guò)質(zhì)膜受體直接作用于受體細(xì)胞或通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)其攜帶的核酸、蛋白質(zhì)等生物活性分子進(jìn)入受體細(xì)胞，參與多種生理過(guò)程。外泌體富集于腫瘤微環(huán)境中，腫瘤源性外泌體已被證明與腫瘤增殖、分化、遷移、耐藥、血管新生以及免疫調(diào)節(jié)相關(guān)[8]。外泌體攜帶的生物活性分子具有其源性細(xì)胞的特征，這提示循環(huán)外泌體具有作為診斷癌癥和評(píng)估預(yù)后的潛在價(jià)值。外泌體具有免疫源性低、在循環(huán)中穩(wěn)定性好、易通過(guò)生物屏障等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，可成為一種新型給藥途徑和基因治療載體。

4.外泌體的分離、純化方法：外泌體具有獨(dú)特的理化性質(zhì)：直徑小(40～100 nm)，區(qū)別于核外顆粒體、脫落小泡和凋亡小體(1 000～5 000 nm)；脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，沉降系數(shù)區(qū)別于蛋白質(zhì)聚集體；具有標(biāo)記蛋白CD63、CD81、Alix、TSG101等。上述特性有助于外泌體的分離和純化，為研究外泌體與疾病相關(guān)性、外泌體用于診斷和治療奠定了基礎(chǔ)。目前采用的分離方法主要包括差速離心法、密度梯度離心法、免疫磁珠法、液相色譜法、超濾離心、基于復(fù)合物的沉淀法，但尚缺乏一種可同時(shí)保證外泌體含量、純度和生物活性的分離方法。Retegui等[9]采用微流控平臺(tái)在3 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)腫瘤特異性細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)與 RNA分離，且允許捕獲的腫瘤 EVs 再釋放，從而進(jìn)行下游的進(jìn)一步研究。

二、外泌體與胃癌的關(guān)系

1.外泌體與胃癌進(jìn)展的關(guān)系

①外泌體與腫瘤微環(huán)境：相比正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞通過(guò)釋放更多的外泌體調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境[10]。腫瘤微環(huán)境是一個(gè)由腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等構(gòu)成的動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)，腫瘤細(xì)胞通過(guò)募集其附近的間質(zhì)細(xì)胞并使其發(fā)生重塑，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。成纖維細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中主要的間質(zhì)細(xì)胞，其“活化”為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)后，可通過(guò)多種途徑促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)，參與腫瘤血管生成和侵襲、轉(zhuǎn)移。外泌體在CAFs 的“活化”、EMT 過(guò)程中起重要作用。Gu 等[11]的研究發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞分泌的外泌體能將TGF-β轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞，通過(guò)激活TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促使人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向CAFs轉(zhuǎn)化。Guan等[12]的研究發(fā)現(xiàn)大劑量質(zhì)子泵抑制劑(PPIs)可抑制胃癌細(xì)胞株SGC-7901外泌體的釋放，進(jìn)而減弱外泌體促CAFs轉(zhuǎn)化和細(xì)胞因子釋放作用。該研究還發(fā)現(xiàn)大劑量的PPIs不僅可調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)信號(hào)通路，從而抑制胃癌進(jìn)展，亦能增強(qiáng)抗腫瘤藥物的作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅是PPIs在胃癌治療中的重要發(fā)現(xiàn)，亦是明確外泌體參與調(diào)控腫瘤微環(huán)境，有望成為胃癌治療靶點(diǎn)的重要啟示。此外，Zhang等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞以分泌外泌體的形式將表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)遞送至肝臟并整合至肝基質(zhì)細(xì)胞的質(zhì)膜上，進(jìn)而有效激活肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor， HGF)，上調(diào)的HGF與癌細(xì)胞c-MET受體結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)移性肝癌生長(zhǎng)。

②外泌體與胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲：胃癌源性外泌體攜帶的蛋白質(zhì)和miRNAs在腫瘤的增殖和侵襲中起關(guān)鍵作用。Li等[14]分別采用高表達(dá)CD97的胃癌細(xì)胞(SGC/wt)和低表達(dá)CD97的胃癌細(xì)胞(SGC/kd)分泌的外泌體處理胃癌細(xì)胞，經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SGC/wt分泌的外泌體通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括上調(diào)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK),c-Jun氨基末端激酶(JNK)和MAPK p38來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲。SGC/wt細(xì)胞來(lái)源外泌體攜帶的miRNAs可能與CD97相關(guān)信號(hào)通路激活有關(guān)，在CD97對(duì)腫瘤細(xì)胞行為的調(diào)控中扮演重要角色。Mao等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，p53缺陷小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體可通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)通路將泛素蛋白連接酶E3α2(ubiquitin protein ligase E3 component n-recognin 2,UBR2)轉(zhuǎn)移至小鼠前胃癌細(xì)胞，促進(jìn)胃癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。該研究提供了胃癌進(jìn)展的新機(jī)制，為胃癌治療提供了新思路。Deng等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞株MGC803來(lái)源的外泌體可破壞腹膜間皮細(xì)胞層的完整性，使間皮下組織暴露于腹腔，利于種植轉(zhuǎn)移瘤的生成，其機(jī)制與MAPK/ERK信號(hào)通路激活后外泌體誘導(dǎo)腹膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡和間皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)。Let-7 miRNAs是Ras和高遷移率族蛋白A2的抑癌基因。Ohshima等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者的let-7a miRNAs血漿濃度低于正常人，且腫瘤細(xì)胞分化越低，其表達(dá)下降越明顯，推測(cè)胃癌細(xì)胞具有高轉(zhuǎn)移性可能與細(xì)胞主動(dòng)將let-7a miRNAs以外泌體形式排出有關(guān)。

2.外泌體在胃癌診斷中的應(yīng)用：外泌體的體積和其攜帶的蛋白質(zhì)、核酸可反映起源細(xì)胞的狀態(tài)和類型。因此，循環(huán)中的腫瘤外泌體有助于腫瘤的早期診斷、液體活檢。液體活檢是通過(guò)檢測(cè)血液、尿液等體液中的某些生物活性分子進(jìn)而對(duì)疾病作出診斷的方法，具有非侵入性、快速、經(jīng)濟(jì)和可重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)[18]。目前液體活檢的檢測(cè)對(duì)象主要包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞、血漿游離DNA和外泌體[19]。M?hrmann等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于BRAF、KRAS和EGFR 基因突變的檢測(cè)，血漿外泌體核酸的敏感性更高。Loei等[21]采用相對(duì)和絕對(duì)定量放射性核素標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析胃癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體蛋白譜后，發(fā)現(xiàn)血清顆粒體蛋白(granulin,GRN)在胃腫瘤組織尤其是早期胃癌中的表達(dá)水平顯著高于正常胃組織。受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析亦證實(shí)血清GRN可作為診斷胃癌的生物學(xué)標(biāo)記物。Tokuhisa等[22]采用基因測(cè)序和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)檢測(cè)外泌體miRNA譜，發(fā)現(xiàn)miRNA-21在惡性癌腹水中的信號(hào)強(qiáng)度最高；5個(gè)miRNAs (miR-1225-5p、miR-320c、miR-1202、miR-1207-5p和miR-4270)在惡性癌腹水、胃癌患者腹腔灌洗液和胃癌細(xì)胞培養(yǎng)液中表達(dá)均增高，可能與胃癌細(xì)胞腹腔擴(kuò)散相關(guān)，其中miR-1225-5p在惡性癌腹水和腹腔灌洗液中的差異表達(dá)最顯著。該研究表明外泌體miR-1225-5p和miRNA-21可提示胃癌的漿膜侵襲性，是胃癌術(shù)后腹腔復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的潛在生物學(xué)標(biāo)記物。此外，有研究證實(shí)不同腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體具有不同的整合素表達(dá)譜，與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的器官傾向性相關(guān)：整合素α6β4和α6β1與肺轉(zhuǎn)移有關(guān)，整合素αvβ5與肝轉(zhuǎn)移有關(guān)[23]。外泌體整合素可作為腫瘤轉(zhuǎn)移器官傾向性的重要診斷指標(biāo)。

3.外泌體在胃癌治療中的作用：Han等[24]指出，外泌體對(duì)生物制藥業(yè)具有一定意義。將中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞分泌的外泌體補(bǔ)充至細(xì)胞培養(yǎng)基可安全、有效地增加CHO細(xì)胞的活性，顯著提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量和質(zhì)量。CHO細(xì)胞是生物制藥的原料細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于治療性蛋白的生產(chǎn)。日本京都大學(xué)研究人員利用編碼融合鏈霉親和素(streptavidin,SAV)和乳凝集素(lactadherin,LA)的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染鼠黑色素瘤B16BL6細(xì)胞制備出的表達(dá) SAV-LA 的外泌體與生物素化的CpG DNA組合，制備出CpG DNA 修飾的外泌體CpG-SAV-exo，發(fā)現(xiàn)CpG-SAV-exo可有效激活鼠樹(shù)突細(xì)胞并增強(qiáng)腫瘤抗原呈遞能力[25]。在胃癌治療方面，Gobbo等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤源性外泌體表面的 HSP70分子在腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸中起重要作用，抑制其活性可提高腫瘤免疫療法的療效。同期有研究者發(fā)現(xiàn)可通過(guò)熱激胃癌細(xì)胞獲得高表達(dá) HSP70的外泌體來(lái)致敏樹(shù)突細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答[27]。研究指出，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)外泌體排出化療藥物從而導(dǎo)致耐藥，提示外泌體可能成為攻克腫瘤耐藥的重要靶點(diǎn)[28]。不斷有研究提出外泌體作為藥物載體或基因治療載體的設(shè)想，找到最優(yōu)的供體細(xì)胞是構(gòu)建一個(gè)有效的外泌體藥物遞送的前提，未成熟樹(shù)突細(xì)胞是外泌體的理想供體細(xì)胞[29]。目前，可通過(guò)外泌體遞送的藥物類型有小干擾RNA(siRNAs)[30-31]、miRNAs[32]、小分子化合物如姜黃素[33]、抗腫瘤藥物紫杉醇和阿霉素[34]等。Zhang等[31]的研究顯示，轉(zhuǎn)染了HGF siRNA的外泌體可減緩癌細(xì)胞及其血管的生長(zhǎng)速度。Wang 等[35]用轉(zhuǎn)染了miRNA-21抑制劑的巨噬細(xì)胞來(lái)源外泌體處理胃癌細(xì)胞株BGC-823，使其 miRNA-21表達(dá)水平下降，結(jié)果顯示癌細(xì)胞凋亡增加、轉(zhuǎn)移能力顯著下降，且外泌體限制了抑制劑對(duì)正常細(xì)胞的毒性。上述研究說(shuō)明外泌體不僅可作為藥物治療的載體，其本身亦具有影響腫瘤代謝和免疫調(diào)節(jié)的優(yōu)勢(shì)，可利用這些優(yōu)勢(shì)解決胃癌治療中常規(guī)化學(xué)制劑對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用的問(wèn)題。

三、結(jié)語(yǔ)

綜上所述，腫瘤來(lái)源外泌體通過(guò)多種機(jī)制參與胃癌的進(jìn)展、侵襲、耐藥、免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程。外泌體在胃癌的早期診斷、藥物治療或基因治療靶向載體等方面均有良好的臨床應(yīng)用前景，是目前研究的熱點(diǎn)。但仍存在如下難題：①如何高效分離外泌體與其他類型的細(xì)胞外囊泡，同時(shí)保證外泌體數(shù)量、純度和生物活性，為下游研究提供條件；②如何優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化外泌體的純化方法，并對(duì)獲得的外泌體進(jìn)行有效定量和定性；③外泌體載藥的方式有電穿孔法、轉(zhuǎn)染外泌體法、轉(zhuǎn)染母代細(xì)胞等方法，各有優(yōu)勢(shì)和缺陷，有待進(jìn)一步優(yōu)化；④如何提高載藥外泌體靶向性以解決腫瘤靶向治療問(wèn)題等?？傊?，隨著人們對(duì)細(xì)胞外分泌、跨膜分泌等機(jī)制的深入研究，各種高敏感性、高特異性和高通量的分析手段的應(yīng)用定會(huì)解決上述難題，為外泌體在胃癌診療中的應(yīng)用開(kāi)創(chuàng)新紀(jì)元。