陳 立 王承黨

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科 消化系病研究室(350005)

背景：糞菌移植(FMT)能減輕炎癥性腸病(IBD)患者腸黏膜炎癥、改善臨床癥狀，但具體作用機(jī)制尚未明確。目的：探討FMT對(duì)葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠內(nèi)臟敏感性的影響。方法：小鼠飲用2.0% DSS溶液制備結(jié)腸炎模型。將40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A組)、模型對(duì)照組(B組)、雙歧桿菌三聯(lián)活菌組(C組)、糞便濾液組(D組)，分別給予0.9% NaCl溶液、0.9% NaCl溶液、雙歧桿菌三聯(lián)活菌液、糞便濾液灌腸。計(jì)算小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分；測(cè)定不同結(jié)直腸擴(kuò)張(CRD)容積時(shí)腹壁肌電幅值變化；免疫組化法測(cè)定腰骶髓P物質(zhì)(SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)表達(dá)。結(jié)果：B組小鼠DAI、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分和腰骶髓SP表達(dá)明顯高于A組、C組和D組(P<0.05)；而A、C、D三組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。擴(kuò)張容積為0.04、0.06、0.08 mL時(shí)，B組腹壁肌電幅值顯著高于A組、C組和D組(P<0.05)，且與SP表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。四組小鼠腰骶髓CGRP表達(dá)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：FMT可改善結(jié)腸炎小鼠的內(nèi)臟敏感性、減少腰骶髓SP表達(dá)，其降低內(nèi)臟敏感性的作用可能與抑制脊髓背角SP表達(dá)有關(guān)。

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)常表現(xiàn)為反復(fù)腹痛、腹瀉、黏液膿血便等，部分緩解期IBD患者也常出現(xiàn)腹痛、排便異常等腸易激綜合征(IBS)樣癥狀[1]，內(nèi)臟高敏感被認(rèn)為是IBD和IBS患者相關(guān)疼痛癥狀的主要病理生理機(jī)制[2-3]。處于緩解期甚至黏膜已愈合的IBD患者出現(xiàn)IBS樣癥狀是提示還存在炎癥活動(dòng)還是合并IBS，這一問題目前仍不明確。臨床上需一種治療措施既可拮抗腸道炎癥又能減輕處于疾病活動(dòng)期或緩解期患者的臨床癥狀(無論是由炎癥活動(dòng)還是合并功能性疾病引起)。糞菌移植(fecal microbiota transplantation,FMT)是一種將健康人的糞便以混懸液方式通過一定途徑輸入至患病個(gè)體腸道內(nèi)以恢復(fù)或補(bǔ)充正常腸道菌群，從而實(shí)現(xiàn)疾病治療目的的治療手段[4]。FMT可用于治療IBD，但具體作用機(jī)制仍處于研究探討中。本研究通過葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)建立小鼠結(jié)腸炎模型并給予糞便濾液灌腸治療，旨在探討FMT對(duì)內(nèi)臟敏感性的影響及其可能機(jī)制，從而為IBD的臨床診治提供一定的依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性清潔級(jí)健康C57BL/6小鼠50只，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。用混合配方飼料(由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，每日更換飲水、飼料，定期更換墊料，保持小鼠生活環(huán)境通風(fēng)和清潔衛(wèi)生。

2.主要試劑與器材：DSS購(gòu)自MP Biomedicals Inc,；雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊購(gòu)自上海信誼藥廠有限公司；尿糞隱血試驗(yàn)試劑購(gòu)自南京建成生物工程研究所；濃縮型兔抗小鼠P物質(zhì)(SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，工作濃度分別為1∶100、1∶50；免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。多道生理信號(hào)采集系統(tǒng)(RM6240BD，成都儀器廠)；數(shù)字顯微攝像系統(tǒng)(Olympus公司)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.小鼠糞便濾液的制備：參照Cui等[5]的研究方法制作糞便濾液。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理：隨機(jī)選取10只小鼠作為糞便供體組，余40只小鼠按1∶3的比例隨機(jī)分成正常對(duì)照組(A組，n=10)和模型組(n=30)。模型組小鼠參照Chassaing等[6]的方法自由飲用 2.0% DSS(w/w,20g/L)蒸餾水溶液7 d，誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎，然后改飲用蒸餾水；A組小鼠自由飲用蒸餾水。實(shí)驗(yàn)第8天，將模型組隨機(jī)分為模型對(duì)照組(B組)、雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊組(C組)、糞便濾液組(D組)，每組各10只。實(shí)驗(yàn)第11天，A、B組小鼠給予0.9% NaCl溶液灌腸(1.0 mL)，C組給予雙歧桿菌三聯(lián)活菌液灌腸(1.0 mL,0.255 g/kg)[7]，D組給予糞便濾液灌腸(1.0 mL,15.197 g/kg)[8]，2次/d，0.5 mL/次，間隔1 d，總共6次。灌腸治療結(jié)束2 d后，參照La等[9]和劉瑋等[10]的方法行結(jié)直腸擴(kuò)張(CRD)，擴(kuò)張容積為0.02、0.04、0.06、0.08 mL時(shí)測(cè)定小鼠腹外斜肌肌電。

3.疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)[11]：每天觀察并記錄小鼠進(jìn)食、飲水、精神、活動(dòng)、排便等情況，稱重體質(zhì)量，計(jì)算DAI評(píng)分。

4.結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分：CRD實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉小鼠，剖腹取病變明顯的遠(yuǎn)端結(jié)腸，行病理學(xué)檢查并進(jìn)行評(píng)分。正常腸黏膜，0分；黏膜層輕度炎癥和水腫，基底部1/3隱窩消失，1分；黏膜層中度炎癥，基底部2/3隱窩消失，2分；黏膜層中度炎癥，隱窩完全消失，但上皮層尚完整，3分；黏膜層、黏膜下層、肌層中度炎癥，隱窩和上皮層消失，4分[12]。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野，組織病理學(xué)評(píng)分取均值。

5.腰骶髓免疫組化染色：取腰膨大以下L6-S1脊髓節(jié)段，經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚切片。采用免疫組化SP法檢測(cè)SP和CGRP表達(dá)，具體步驟參照試劑盒說明書操作。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野，采用IPP 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算，取均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況和DAI評(píng)分

A組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中毛色光整，反應(yīng)靈活，活動(dòng)、進(jìn)食、排便均正常，體質(zhì)量增加。模型組小鼠飲用2.0% DSS溶液后逐漸出現(xiàn)毛色不光整，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)、進(jìn)食減少，糞便呈糊狀，且次數(shù)增多，糞便隱血試驗(yàn)陽(yáng)性，第5天開始出現(xiàn)不同程度的體質(zhì)量下降，停用DSS后體質(zhì)量仍繼續(xù)下降；實(shí)驗(yàn)第10天，即灌腸前1天C組和D組各有1只小鼠死亡，解剖發(fā)現(xiàn)結(jié)腸明顯充血、水腫、潰瘍。造模后，B組、C組、D組之間DAI相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。灌腸后，A組、C組、D組DAI均顯著均低于B組(P<0.05)，而這三組之間無明顯差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組小鼠DAI和結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分比較

*與B組比較，P<0.05

二、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分

DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎組織學(xué)表現(xiàn)為腸黏膜上皮細(xì)胞間斷壞死脫落，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，多為中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，間質(zhì)有輕微水腫，腺體排列基本規(guī)則；給予灌腸后，C組和D組腸組織損傷減輕(圖1)。A組、C組、D組組織病理學(xué)評(píng)分均顯著低于B組(P<0.05)，而這三組之間無明顯差異(P>0.05)(表1)。

三、小鼠腹壁肌電變化

各組小鼠腹壁肌電幅值隨著擴(kuò)張容積的升高而增高。CRD容積為0.02 mL時(shí)，四組小鼠腹壁肌電幅值無明顯差異(F=0.814，P=0.500)。CRD容積為0.04、0.06、0.08 mL時(shí)，B組腹壁肌電幅值顯著高于A組、C組、D組(P<0.05)，而后三組之間擴(kuò)張容積為0.04、0.06 mL的腹壁肌電幅值相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

四、小鼠腰骶段脊髓背角SP、CGRP表達(dá)

1.脊髓背角SP表達(dá)：SP陽(yáng)性神經(jīng)元集中分布于脊髓背角淺層，呈細(xì)胞質(zhì)內(nèi)褐色顆?；蚣?xì)絲狀，對(duì)稱分布。A組、C組和D組SP表達(dá)均顯著低于B組(P=0.000，P=0.010，P=0.035)，而這三組之間無明顯差異(P>0.05)(圖2、表3)。

2.脊髓背角CGRP表達(dá)：CGRP陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)于脊髓背角，呈細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒。四組小鼠CGRP表達(dá)無明顯差異(F=1.530，P=0.225)(圖3、表3)。

五、脊髓背角SP、CGRP表達(dá)水平與腹壁肌電幅值的相關(guān)性分析

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)結(jié)果(HE染色，×200)

表2 不同擴(kuò)張容積時(shí)各組小鼠腹壁肌電幅值比較

與B組比較，*P<0.05，**P<0.01；#與A組比較，P<0.05

圖3 各組小鼠脊髓背角CGRP表達(dá)情況(免疫組化染色，×400)

表3 各組脊髓背角SP、CGRP表達(dá)

*與B組比較，P<0.05

CRD擴(kuò)張容積為0.04、0.06、0.08 mL時(shí)，脊髓背角SP表達(dá)與腹壁肌電幅值之間呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.467，P=0.016；r=0.517，P=0.007；r=0.588，P=0.002)；擴(kuò)張容積為0.02 mL時(shí)，兩者之間無明顯相關(guān)性(r=0.200，P=0.327)。

CRD擴(kuò)張容積為0.02、0.04、0.06、0.08 mL時(shí)，脊髓背角CGRP表達(dá)與腹壁肌電幅值之間無相關(guān)性(P>0.05)。

討 論

本研究結(jié)果提示，糞便濾液灌腸治療可改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)改變、降低腹壁肌電幅值、下調(diào)脊髓痛覺相關(guān)分子SP表達(dá)，說明FMT可改善結(jié)腸炎小鼠的內(nèi)臟敏感性。

FMT因用于治療艱難梭菌相關(guān)性腸炎療效顯著且能改善IBD病情而成為近年研究熱點(diǎn)。FMT可使UC患者恢復(fù)腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能、減輕腸道炎癥，甚至可逐漸達(dá)到完全性黏膜愈合[13]。現(xiàn)有觀點(diǎn)認(rèn)為疾病的改善與接受FMT后患者腸道細(xì)菌組成的長(zhǎng)時(shí)間改變和糞便混懸液中供者細(xì)菌產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。但也有研究[14]發(fā)現(xiàn)經(jīng)FMT治療后UC患者腸道菌群的轉(zhuǎn)變與臨床癥狀之間無相關(guān)性，提示FMT的作用可能不僅僅是通過改變腸道菌群組成而實(shí)現(xiàn)的。

本研究中，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠在經(jīng)糞便濾液灌腸后，DAI和結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分均較模型對(duì)照組改善，提示炎癥緩解。CRD實(shí)驗(yàn)中，0.02 mL擴(kuò)張容積下各組間腹壁肌電水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮此壓力可能尚未達(dá)到小鼠疼痛閾值；而在0.04、0.06、0.08 mL 擴(kuò)張容積下，糞便濾液組腹壁肌電幅值明顯低于模型對(duì)照組，而與正常對(duì)照組無明顯差異，說明FMT可降低結(jié)腸炎小鼠內(nèi)臟敏感性。因此，當(dāng)有適應(yīng)證的患者進(jìn)行FMT治療時(shí)，不僅可控制腸道炎癥，而且還可通過降低內(nèi)臟高敏感來減輕疾病活動(dòng)期或緩解期可能出現(xiàn)的腹痛、腹瀉等癥狀。但本研究的動(dòng)物模型是急性腸炎模型，急性炎癥時(shí)因FMT治療而得到控制的內(nèi)臟高敏感是否能長(zhǎng)期維持尚不明確，仍需行FMT長(zhǎng)程療效的觀察研究以明確其是否能對(duì)內(nèi)臟敏感性產(chǎn)生遠(yuǎn)期影響。

SP是脊髓水平傳遞傷害性信息的重要神經(jīng)遞質(zhì)，其升高與炎癥引起的腹痛程度密切相關(guān)，SP在腸道炎癥引起的脊髓背角神經(jīng)元敏感化中起重要作用[15]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)糞便濾液干預(yù)治療后，小鼠結(jié)腸炎癥減輕，SP表達(dá)顯著低于模型對(duì)照組，且與擴(kuò)張容積為0.04、0.06、0.08 mL時(shí)的腹壁肌電幅值之間存在正相關(guān)關(guān)系。說明內(nèi)臟敏感性增高與SP表達(dá)水平有關(guān)，F(xiàn)MT可降低結(jié)腸炎性刺激引起的脊髓背角神經(jīng)元敏感化，并通過抑制SP釋放來阻斷痛覺信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。CGRP是外周感覺傳入神經(jīng)元中與SP共存的一種神經(jīng)肽，不僅可直接產(chǎn)生傷害性作用，還參與炎癥誘導(dǎo)的內(nèi)臟傷害性感覺[16]。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)灌腸干預(yù)后的各組CGRP表達(dá)無明顯差異，提示FMT可能并非主要通過影響脊髓中CGRP表達(dá)來發(fā)揮作用；此外，本研究中DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型的炎癥程度較輕，從而未能引起脊髓背角CGRP表達(dá)明顯增加，是否更嚴(yán)重的炎癥情況下FMT可降低CGRP表達(dá)仍有待進(jìn)一步研究。

雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊是由雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸球菌組成的活菌制劑，可補(bǔ)充腸道有益菌，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡以及黏膜免疫功能，抑制有害微生物的生長(zhǎng)繁殖。一項(xiàng)meta分析表明，益生菌治療有益于UC患者的誘導(dǎo)緩解，其維持緩解的效果與5-氨基水楊酸相當(dāng)[17]。本實(shí)驗(yàn)中糞便濾液組和雙歧桿菌三聯(lián)活菌組之間DAI評(píng)分、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分、腹壁肌電幅值以及腰骶髓SP、CGRP表達(dá)均無明顯差異，且兩組與正常對(duì)照組之間亦無明顯差異。理論上而言，F(xiàn)MT為原生態(tài)腸道菌群重建，效果應(yīng)優(yōu)于雙歧桿菌三聯(lián)活菌單獨(dú)治療的效果，導(dǎo)致兩者療效無差異可能的原因包括：①本實(shí)驗(yàn)中糞便濾液制作技術(shù)條件有限，糞便收集過程不能達(dá)到理想的無菌、無氧等狀態(tài)；② 2.0% DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型炎癥程度較輕，加之實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，小鼠結(jié)腸炎有一定的自愈傾向。

綜上所述，本研究中FMT可減輕DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥，降低腹壁肌電幅值和腰骶髓SP表達(dá)。提示FMT具有降低內(nèi)臟敏感性的作用，這種作用可能與抑制脊髓背角SP表達(dá)有關(guān)，這為FMT在IBD的治療中提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。