王 婷 許 冰 張 靜 鄭 瑩 董 蕾

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 陜西省胃腸動力疾病研究重點(diǎn)實驗室(710004)

背景：結(jié)直腸癌(CRC)是消化系統(tǒng)常見腫瘤，發(fā)病率和死亡率較高。目的：應(yīng)用生物信息學(xué)方法對CRC差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，篩選與CRC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因。方法：從公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(GEO)下載CRC基因芯片GSE32323、GSE21510、GSE9348數(shù)據(jù)集，使用R語言篩選差異表達(dá)基因。在DAVID數(shù)據(jù)庫中對差異表達(dá)基因行GO和KEGG分析。應(yīng)用STRING、Cytoscape構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，篩選出CRC的核心基因。結(jié)果：在三個數(shù)據(jù)集中共篩選出834個CRC共同差異表達(dá)基因，包括376個上調(diào)基因和456個下調(diào)基因。GO分析表明差異表達(dá)基因主要參與細(xì)胞分裂、增殖、代謝等過程。KEGG分析顯示差異表達(dá)基因主要富集于p53通路和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白通路。PPI網(wǎng)絡(luò)共篩選出20個核心基因。結(jié)論：運(yùn)用生物信息學(xué)方法對CRC基因芯片進(jìn)行分析可為CRC發(fā)病機(jī)制、腫瘤標(biāo)記物的篩選和治療藥物靶點(diǎn)的選擇提供理論基礎(chǔ)。

結(jié)直腸癌(CRC)是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在全部腫瘤中位居第三位，死亡率在男性腫瘤和女性腫瘤中分別位居第二、第三位[1-2]?；蛲蛔?、微環(huán)境改變等與CRC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。近年CRC的篩查、診斷、治療等取得了較大的進(jìn)展，但仍存在早期診斷困難、腫瘤易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、5年生存率低等問題。因此，探究與CRC相關(guān)的新的基因、分子標(biāo)記物、分子治療靶點(diǎn)等對研究CRC的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防和治療具有重要意義。

基因芯片是一種可快速、高通量獲取基因表達(dá)信息的微陣列技術(shù)，不僅可作為研究腫瘤相關(guān)分子機(jī)制的新方法，也可用于臨床分子標(biāo)記物的預(yù)測和靶向藥物的研發(fā)。本研究通過公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO)獲取三個CRC基因芯片數(shù)據(jù)，篩選出差異表達(dá)基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，最終篩選出20個核心基因，旨在為進(jìn)一步揭示CRC的發(fā)病機(jī)制提供方向。

材料與方法

一、材料來源

從美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GEO[3]公共數(shù)據(jù)庫中下載基于GPL570平臺的三個基因芯片GSE32323、GSE21510、GSE9348數(shù)據(jù)集。其中GSE32323包含17對配對的CRC組織和癌旁組織，GSE21510包含123例CRC組織和25例癌旁組織，GSE9348包含70例CRC組織和12例正常人結(jié)腸組織。

二、共同差異基因分析

利用R語言exprs函數(shù)提取基因表達(dá)矩陣文件，再應(yīng)用R語言中的limma包分析數(shù)據(jù)集中的差異表達(dá)基因，差異表達(dá)基因篩選條件為|log 2差異倍數(shù)|≥1且P<0.01。利用FunRich Version 3.0軟件分析三個數(shù)據(jù)集中的共同差異表達(dá)基因，MeV軟件對共同差異表達(dá)基因行層次聚類分析。

三、GO分析和KEGG富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫[4]對差異表達(dá)基因進(jìn)行富集，行GO分析[5](以P<0.01設(shè)定為納入標(biāo)準(zhǔn))和KEGG分析[6](以P<0.05設(shè)定為納入標(biāo)準(zhǔn))。

四、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)和子模塊基因構(gòu)建分析

應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫[7]行PPI分析，并利用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化，行MCODE分析，篩選提取子網(wǎng)絡(luò)，篩選條件設(shè)置為Degree cut off=2，node score cut off=0.2，k-core=2，以及max depth=100；并計算每個蛋白節(jié)點(diǎn)的Degree值，篩選核心基因。

結(jié) 果

一、CRC差異表達(dá)基因的篩選

從GSE32323、GSE21510、GSE9348數(shù)據(jù)集中分別篩選出1 420個、3 233個、3 010個差異表達(dá)基因(表1)，其中834個基因在這三個數(shù)據(jù)集中均有表達(dá)(圖1)，376個基因表達(dá)上調(diào)，456個表達(dá)下調(diào)(圖2)(其余2個基因在三個數(shù)據(jù)集中的表達(dá)不一致)。

二、GO和KEGG分析

GO分析結(jié)果顯示，CRC中表達(dá)上調(diào)的376個基因主要參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分裂、DNA復(fù)制、膠原分解、細(xì)胞凋亡等過程(表2)，表達(dá)下調(diào)的基因主要參與代謝、炎癥、離子運(yùn)輸、單核細(xì)胞趨化等過程(表3)。KEGG通路富集分析顯示表達(dá)上調(diào)的基因主要在細(xì)胞周期、p53通路、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)通路中富集(表4)。

表1 三個數(shù)據(jù)集中CRC差異表達(dá)基因的分布情況 (n)

A：GSE32323；B：GSE21510；C：GSE9348

A：共同差異表達(dá)基因；B：共同高表達(dá)基因；C：共同低表達(dá)基因

表2 表達(dá)上調(diào)基因的GO分析

表3 表達(dá)下調(diào)基因的GO分析

圖3 PPI子網(wǎng)絡(luò)圖

表4 CRC中高表達(dá)基因的KEGG通路富集分析結(jié)果

三、PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析表達(dá)上調(diào)的基因顯示共有79個蛋白節(jié)點(diǎn)、369條連接線(Score>0.04，P<0.01)。應(yīng)用Cytoscape軟件的MCODE法分析，結(jié)果顯示2個子網(wǎng)絡(luò)處于核心位置，共包含66個高表達(dá)關(guān)鍵基因(圖3)。根據(jù)Degree值，篩選出前20個核心差異表達(dá)基因，分別為TOP2A、CDK1、CCNB1、MAD2L1、RFC4、AURKA、MCM4、BUB1B、CDC6、TTK、NCAPG、CDKN3、TPX2、DLGAP5、MCM2、ASPM、DTL、MCM3、TRIP13、KIF20A(圖4)。

討 論

利用基因芯片檢測基因表達(dá)情況，并應(yīng)用生物信息分析技術(shù)對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，最終將結(jié)果可視化，可發(fā)現(xiàn)在疾病發(fā)展中起重要作用的基因，以及可能潛在的分子機(jī)制。目前大多數(shù)基因芯片的研究集中在單獨(dú)芯片的數(shù)據(jù)分析，但由于不同平臺、不同樣本、不同研究者之間存在差異，可能導(dǎo)致基因芯片數(shù)據(jù)的不穩(wěn)定。為了增加數(shù)據(jù)的可靠性，本研究選取三個基因芯片，取交集以確保篩選出的差異表達(dá)基因的可信度。

圖4 Degree值最高的20個核心基因

多項研究已證實p53基因突變、細(xì)胞周期阻滯、異常細(xì)胞分裂、增殖、DNA復(fù)制等與CRC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8-11]。p53是一種重要的腫瘤抑制基因，可調(diào)節(jié)不同的下游基因，在多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要功能[8]。不同的細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下，p53可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡、衰老，如DNA損傷、缺氧、癌基因激活等。p53的激活可觸發(fā)線粒體和死亡受體誘導(dǎo)的凋亡途徑[10]。細(xì)胞周期調(diào)控紊亂所致的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞失控性增殖是CRC最基本的生物學(xué)特征之一[9]。細(xì)胞周期受細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)的調(diào)控，故無論是細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白本身表達(dá)失調(diào)，亦或是上游抑癌基因?qū)χ芷谙嚓P(guān)蛋白的調(diào)控，均與CRC的發(fā)生密切相關(guān)。p21WAF1是CDK家族成員，亦為p53下游基因，可阻礙細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)變[11]。同時p53-p21WAF1途徑也可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老[11]。ECM參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長、分化和遷移，重構(gòu)的ECM為腫瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移提供了基礎(chǔ)，在CRC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[12-13]。由此可見，p53信號通路、ECM受體通路，以及細(xì)胞周期調(diào)控紊亂、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程與CRC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，三個數(shù)據(jù)集中表達(dá)上調(diào)的基因376個，456個基因表達(dá)下調(diào)。GO和KEGG分析顯示CRC中表達(dá)上調(diào)的376個基因主要參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分裂、DNA復(fù)制、細(xì)胞凋亡、膠原分解等生物學(xué)過程，并在細(xì)胞周期相關(guān)通路、p53通路和ECM受體通路中富集。

本研究最終篩選出了與CRC發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的20個核心基因。其中TOP2A、CDK1、CCNB1屬細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，染色質(zhì)免疫共沉淀測序證實這3個基因是SOX9的分子靶點(diǎn)，而SOX9與CRC發(fā)生密切相關(guān)[14]。目前研究證實TOP2A在CRC中高表達(dá)，但對CRC患者預(yù)后的作用仍存在爭議。TOP2A是表柔比星藥物的主要分子靶標(biāo)，在DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄期間對維持染色體的拓?fù)錉顟B(tài)起關(guān)鍵作用，這可能有助于CRC的治療[15]。CDK家族、cyclin家族、MCM家族與腫瘤發(fā)生的密切相關(guān)。本研究篩選出的關(guān)鍵核心基因CDK1、CCNB1、MCM2已有報道發(fā)現(xiàn)與CRC有關(guān)[14,16]。MCM3在多種腫瘤中過表達(dá)，參與多種腫瘤的發(fā)生[17]。CDKN3是細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑，Yang等[18]的研究發(fā)現(xiàn)CDKN3可抑制SW480細(xì)胞增殖和遷移，阻滯SW480細(xì)胞周期并誘導(dǎo)其凋亡。有絲分裂紡錘體異常缺陷在腫瘤發(fā)展過程中起重要作用[19]。本研究篩選出的核心基因BUB1B、MAD2L1、TTK、CDC6、TPX2、ASPM、NCAPG等均參與有絲分裂過程。有絲分裂紡錘體組裝檢控點(diǎn)(SAC)是保證細(xì)胞染色體正確分離的重要機(jī)制之一。SAC可監(jiān)控紡錘體微管與著絲點(diǎn)的連接，確保染色體均等分配[20]。SAC基因發(fā)生突變使染色體不能正常分離，可能會導(dǎo)致非整倍體的形成，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[21]。其中BUB、MAD蛋白是SAC的核心蛋白，有研究表明BUB1B、MAD2L1突變與CRC的發(fā)生有關(guān)[22-23]。Wei等[24]的研究表明抑制TPX2表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖和致瘤性，顯著降低結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Xiang等[25]發(fā)現(xiàn)RFC4的缺失可抑制CRC細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)S期阻滯，與CRC預(yù)后不良有關(guān)。Sheng等[26]發(fā)現(xiàn)，TRIP13在體外可促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并在體內(nèi)促進(jìn)皮下腫瘤的形成。Baraniskin等[27]發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p通過靶向結(jié)合DTL抑制結(jié)腸腫瘤的生長。Goos等[28]的研究表明AURKA表達(dá)升高與CRC肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后不良有關(guān)。Niittym?ki等[29]的研究發(fā)現(xiàn)在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性CRC中雜合TTK突變率增加，可能與CRC的發(fā)生有關(guān)。目前尚缺乏MCM4、DLGAP5、KIF20A、CDC6、ASPM、NCAPG與CRC關(guān)系的研究。

總之，本研究采用R語言和生物信息學(xué)分析對三個數(shù)據(jù)集進(jìn)行研究，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選出可能與CRC發(fā)生密切相關(guān)的20個核心基因，其主要參與了CRC異常細(xì)胞分裂、增殖等生物學(xué)過程，參與細(xì)胞周期和p53信號通路。這些發(fā)現(xiàn)提高了對CRC發(fā)病機(jī)制和潛在分子機(jī)制的認(rèn)識，同時為腫瘤標(biāo)記物的篩選和藥物靶點(diǎn)的選擇提供了理論基礎(chǔ)。但仍需進(jìn)一步行分子生物學(xué)實驗和動物實驗來驗證相關(guān)基因的功能。