白子上 曹湜歐 吳重璽 范家齊 和 淵

（中國人民大學附屬中學 北京 100080）

1 研究背景

隨著基因工程技術日趨成熟，利用基因重組技術構建生物工程菌發(fā)酵工藝獲得產品是當前的發(fā)展趨勢，其目的是為了獲得大量的外源基因產物。外源基因的高水平表達受到其所處的環(huán)境條件影響，本實驗主要研究了誘導時間、誘導溫度和誘導劑IPTG 濃度對于蛋白表達的影響。

誘導開始時間的選擇和誘導時長對于目的蛋白的表達水平有重要影響。在大腸桿菌在菌體生長的對數(shù)早期進行誘導，菌體量較少，表達量有限。在對數(shù)晚期進行誘導，由于營養(yǎng)的消耗及代謝物的積累，菌體生長受到抑制，表達量也有所下降。因此，通常選擇大腸桿菌細胞量OD600為0.6～0.8 左右時開始誘導，細菌處于比較理想的狀態(tài)［1］，此后加入誘導劑后的表達時間需要進行摸索才能使表達量優(yōu)化到最佳的水平。

誘導劑的濃度對大腸桿菌蛋白的表達也可能存在影響。操縱子是基因表達和調控的單元，主要見于原核生物的轉錄調控［2］。用乳糖或者其類似物（例如異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG）可以體外啟動基因的表達，因此作為一種誘導外源基因表達的誘導劑被實驗室廣泛使用。

溫度是影響工程菌生長、 質粒穩(wěn)定性和重組產物形成的重要因素。大腸桿菌的最適生長溫度為37℃左右，然而在較高溫度下，細菌的生長速率較高導致發(fā)酵過程中易積累大量代謝副產物，從而對菌體生長和目的蛋白的表達產生抑制［2］。

本實驗通過對不同誘導劑濃度下重組大腸桿菌蛋白PYL10 的表達，探索誘導劑濃度對蛋白表達的影響。

2 材料與方法

2.1 實驗材料 大腸桿菌感受態(tài)細胞E.coliBL21（DE3），PYL10 表達質粒，LB 液體培養(yǎng)基，LB平板，氨芐青霉素，IPTG，考馬斯亮藍R-250；蛋白電泳液，脫色液，超凈工作臺，酒精燈，涂布器，微量移液器，錐形瓶，鋁箔紙，一次性手套，渦旋混合器，離心機，紫外可見光分光光度計，超聲破碎儀，天平，計時器，臺式恒溫振蕩器，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，鎳-純化層析柱，蛋白質電泳儀。

2.2 實驗步驟

2.2.1 目的基因的轉化 取100 μL 冰上融化的BL21（DE3）感受態(tài)細胞于潔凈的1.5 mL 離心管中，加入PYL10 表達質粒2 μL，用微量移液器輕輕吹吸至完全混勻，冰浴25 min。42℃水浴熱激90 s 后，迅速放回冰上靜置2 min，此步驟應減少晃動，以免轉化效率降低。在超凈工作臺內進行操作，加入700 μL 未添加抗生素的LB 液體培養(yǎng)基，用加樣槍輕輕吹吸至混勻，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中以37℃，200 r/min，復蘇60 min。用離心機以5 000 r/min 離心1 min，留取100 μL 左右上清，用移液槍輕輕吹打重懸細胞。用移液槍在含有100 μg/mL 的LB 固 體 平 板 上 加 入8 μL IPTG 和40 μL X-gal，用涂布器涂布均勻后將菌液涂布到平板上。用封口膜封住平板，37℃倒置過夜培養(yǎng)［3-4］。

2.2.2 重組菌株蛋白水平的驗證 取30 mL 含有氨芐抗生素的LB 液體培養(yǎng)基于50 mL 錐形瓶中，加入1mL 菌液后分別37℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h 后加入IPTG 至終濃度為1.0 mmol/L，4 h 后收集菌液，OD600nm比色。用超聲破碎儀將收集的菌體破菌，并用鎳柱純化蛋白后進行SDSPAGE 電泳檢測。取陽性實驗結果作為實驗菌株進行后續(xù)實驗。

2.2.3 不同培養(yǎng)溫度對大腸桿菌表達蛋白的影響 取30 mL 含有氨芐抗生素的LB 液體培養(yǎng)基于50 mL 錐形瓶中，加入1 mL 菌液后分別置于22℃和37℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h 后加入IPTG 至終濃度為1.0 mmol/L，4 h 后收集菌液，OD600nm比色。用超聲破碎儀將收集的菌體破菌，并用鎳柱純化蛋白后進行SDS-PAGE 電泳檢測［5］。

2.2.4 不同誘導劑濃度對大腸桿菌表達蛋白的影響 取30 mL 含有氨芐抗生素的LB 液體培養(yǎng)基于50 mL 錐形瓶中，加入1 mL 菌液后分別置于37℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h 后分別加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L，4 h后收集菌液，OD600nm比色，用超聲破碎儀將收集的菌體破菌，并用鎳柱純化蛋白后進行SDS-PAGE 電泳檢測［7］。

2.2.5 蛋白純化 當E.coli細胞的濃度達到OD600為0.8 左右時，開始誘導，并且記錄開始誘導時間，然后按時間點處理樣品：每個時間點時，將細菌離心沉淀，用細胞裂解液（Lysis buffer）重懸沉淀至10 mL，然后超聲破碎1 min，再次離心，將離心后上清上樣到Ni 柱（0.5 mL）中，用2 mL的柱洗滌液（20 mmol/L 咪唑+細胞裂解液）洗滌3次，最后0.5 mL 的柱洗脫液（250 mmol/L 咪唑+細胞裂解液）洗脫，獲得純化后的目的蛋白樣品［8］。

3 實驗結果

3.1 誘導時間的影響 當E.coli的細胞量達到OD600=0.8 左右時，開始誘導并記錄誘導時間，然后按時間點取樣品1 mL，如表1所示。離心沉淀后，用細胞裂解液50 μL 重懸，取2 μL 重懸起的樣品并加入18 μL 上樣緩沖液，于95℃水浴煮沸5 min，取其中10 μL 液體進行蛋白質電泳。結果如圖1，隨著誘導時間增加，大腸桿菌細胞的全蛋白表達水平隨之提高，各類蛋白濃度均有所增加。這情況同樣存在于純化后PYL10 蛋白的表達水平，并且在培養(yǎng)16 h 后目的蛋白濃度達到最高，如圖2所示。

表1 PYL10蛋白的誘導表達時間條件

3.2 誘導溫度 設置不同的培養(yǎng)溫度條件探索誘導溫度對于蛋白表達的影響，如表2所示。當E.coli細胞的濃度達到約為OD600為0.8 左右時，開始誘導，并且記錄開始誘導時間，達到5 h 時，取細胞培養(yǎng)菌液樣品，將細菌離心沉淀，用細胞裂解液重懸沉淀至10 mL，然后超聲破碎1 min，再次離心，將離心后上清上樣到Ni 柱（0.5 mL）中，用2 mL 的柱洗滌液（20 mmol/L 咪唑+細胞裂解液）洗滌3 次，最后0.5 mL 的柱洗脫液（250 mmol/L咪唑+細胞裂解液）洗脫，獲得純化后的目的蛋白樣品。結果如圖3所示，隨著誘導溫度條件的提高，PYL10 蛋白表達水平隨之提高，在22℃達到最大，當溫度達到37℃時，PYL10 蛋白表達水平相對降低。

表2 PYL10 蛋白的誘導表達溫度條件

3.3 誘導劑IPTG 濃度

表3 PYL10 蛋白表達的誘導劑不同濃度

按照表3所示，設置不同的IPTG 誘導濃度條件探索，當E.coli 細胞的濃度達到OD600約為0.8左右時，開始誘導，并且記錄開始誘導時間。當達到12 h，取細胞培養(yǎng)菌液樣品，將細菌離心沉淀，用細胞裂解液重懸沉淀至10 mL，然后超聲破碎1 min，再次離心，將離心后上清上樣到Ni 柱（0.5 mL）中，用2 mL 的柱洗滌液（20 mmol/L 咪唑+細胞裂解液）洗滌3 次，最后0.5 mL 的柱洗脫液（250 mmol/ L 咪唑+細胞裂解液）洗脫，獲得純化后的目的蛋白樣品。結果如圖4所示，當誘導劑IPTG 濃度增加到200 μmol/L 時，PYL10 蛋白表達量最高。

4 實驗結論和討論

實驗結果表明，在22℃時加入200 μmol/L 的IPTG 誘導表達16 h 最適合PYL10 的蛋白表達，這一結果與已發(fā)表論文中提到的結果是一致的［9］。本文新意在于系統(tǒng)性地探索了每個變量（表達溫度、表達時間和誘導劑濃度）對于PYL10 蛋白表達的影響,并且將每個優(yōu)化后的結果結合在一起, 以期找到一個最優(yōu)化的、使得PYL10 蛋白表達量最大的條件。

盡管在22℃和37℃時培養(yǎng)菌液的吸光度值相近，即細胞密度無明顯差異，但22℃時大腸桿菌蛋白表達明顯高于37℃，可能是與在37℃時蛋白表達太快、折疊不好有關［10］。另外，IPTG 作為一種廣泛應用的誘導劑，可競爭性地與阻遏蛋白結合從而啟動目的蛋白的轉錄。如果濃度過低則達不到與阻遏蛋白結合的飽和濃度從而對目的蛋白的表達造成影響，如果濃度過高則造成經濟上的不劃算，因此0.2 mmol/L 的IPTG 濃度已經足夠誘導重組蛋白的表達。