通心絡對高糖誘導人視網膜微血管內皮細胞損傷的保護作用

位庚 曹柳 張?zhí)K明 侯鳳英 趙玉莎 何素彥

[摘要] 目的 探討通心絡對高糖誘導人視網膜微血管內皮細胞（HRCECs）損傷的干預作用及其相關機制。 方法 用高糖培養(yǎng)基建立細胞損傷模型，采用隨機數字表法將HRCECs分為正常對照組（normal組）、模型組（model組，30 mmol/L葡萄糖）、通心絡低劑量組（TXL-L組，100 μg/mL通心絡）、通心絡中劑量組（TXL-M組，200 μg/mL通心絡）、通心絡高劑量組（TXL-H組，400 μg/mL通心絡）。檢測各組細胞生存活性，細胞上清液內皮素-1（ET-1）、白介素-6（IL-6）和細胞間黏附因子-1（ICAM-1）含量，以及細胞內皮型一氧化氮合酶（eNOS）和核轉錄因子-κB（NF-κB）的蛋白表達情況。 結果 與normal組比較，model組細胞生存活性明顯降低，細胞上清液中ET-1、IL-6和ICAM-1含量升高，細胞eNOS蛋白表達下調，NF-κB蛋白表達上調（P < 0.01）;與model組比較，TXL-M組和TXL-H組細胞上清液ET-1含量明顯減少（P < 0.01），TXL-L組、TXL-M組和TXL-H組細胞上清液IL-6和ICAM-1含量明顯減少，eNOS蛋白表達上調，NF-κB蛋白表達下調（P < 0.05或P < 0.01）。 結論 通心絡可明顯改善高糖誘導的HRCECs損傷，并通過減輕炎癥損傷發(fā)揮細胞保護作用。

[關鍵詞] 通心絡;人視網膜微血管內皮細胞;高糖;炎癥

[中圖分類號] R774;R285.5 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2018）12（c）-0012-04

[Abstract] Objective To explore the intervention effects and related mechanism of Tongxinluo on high glucose-induced human retinal capillary endothelial cells （HRCECs） injury. Methods The cells damaged model was established with high glucose. The HRCECs were divided into normal group， model group （30 mmol/L glucose）， Tongxinluo low dose group （TXL-L group， 100 μg/mL Tongxinluo）， Tongxinluo middle dose group （TXL-M group， 200 μg/mL Tongxinluo） and TXL high dose group （TXL-H group， 400 μg/mL Tongxinluo） by random number table method. The cell viability， contents of endothelin （ET）-1， interleukin （IL）-6 and intercellular adhesion molecule （ICAM）-1 in supernatant， and the endothelial nitric oxide synthase （eNOS） and nuclear factor （NF）-κB protein expression in cells of each group were detected. Results Compared with normal group， the cell viability was significantly decreased， the contents of ET-1， IL-6 and ICAM-1 in supernatant were significantly increased， the protein expression of eNOS was significantly down-regulated， and the protein expression of NF-κB was significantly up-regulated in model group （P < 0.01）. Compared with model group， the contents of ET-1 in supernatant were significantly decreased in TXL-M group and TXL-H group （P < 0.01）， and the contents of IL-6 and ICAM-1 in supernatant were significantly decreased， the protein expression of eNOS was significantly up-regulated， and the protein expression of NF-κB was significantly down-regulated in TXL-L group， TXL-M group and TXL-H group （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Tongxinluo can signifcantly improve high glucose-induced HRCECs injury， and plays a role in cell protection through reducing inflammatory injury.

[Key words] Tongxinluo; Human retinal capillary endothelial cells; High glucose; Inflammation

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）為糖尿病最為嚴重的微血管并發(fā)癥之一，已成為成年人致盲的主要原因，并且發(fā)病率還在逐年增加。高血糖被認為是導致DR的重要因素，持續(xù)高血糖誘發(fā)的視網膜組織中微血管內皮細胞損傷是DR出現(xiàn)血管病理改變的始動因素[1]。中藥復方制劑通心絡膠囊，在中醫(yī)絡病理論指導下研制而成，對微血管有較好的保護作用[2-4]。已有臨床研究顯示，通心絡對DR有較好的治療作用[5-6]，但其對視網膜微血管的作用機制尚不十分清楚。本研究選用人視網膜微血管內皮細胞（human retinal capillary endothelial cells，HRCECs）為研究對象，高糖誘導HRCECs損傷，模擬人體內高糖環(huán)境對視網膜微血管的影響，觀察通心絡對該損傷的干預作用及其作用機制，為通心絡應用于DR的防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗用細胞

HRCECs購自美國ScienCell公司。

1.2 藥物及試劑

通心絡藥粉由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供（批號：S-130901）;內皮細胞培養(yǎng)基（endothelial cell medium，ECM）（美國ScienCell公司，批號：1001）;CCK-8試劑盒（日本同仁化學研究所，批號：KN868）;內皮素-1（ET-1）、白介素-6（IL-6）及細胞間黏附分子-1（ICAM-1）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20160804、20150916、20160808）;內皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗體及核轉錄因子-κB（NF-κB）p65抗體（美國Abcam公司，批號分別為ab76198、ab16502）。

1.3 主要儀器

Effendrof Centrifuge 5804R離心機（德國Effendrof公司）;YP502N電子天平（上海菁海儀器有限公司，讀數精度：0.01 g）;多功能酶標儀（美國Bio Tek公司）;UVP凝膠掃描系統(tǒng)（美國UVP公司）;電轉膜儀、半干轉膜儀、垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.4 藥物配制

1.5 細胞分組及處理

采用隨機數字表法將細胞分為以下五組（每組平行設置3～4個復孔）：①正常對照組（normal組），正常培養(yǎng);②模型組（model組），含30 mmol/L葡萄糖的ECM無血清培養(yǎng)基培養(yǎng);③通心絡低劑量組（TXL-L組），含通心絡100 μg/mL的無血清ECM培養(yǎng)基預孵育4 h后，換為含葡萄糖30 mmol/L加通心絡100 μg/mL的無血清ECM培養(yǎng)基;④通心絡中劑量組（TXL-M組），含通心絡200 μg/mL的無血清ECM培養(yǎng)基預孵育4 h后，換為含葡萄糖30 mmol/L加通心絡200 μg/mL的無血清ECM培養(yǎng)基;⑤通心絡高劑量組（TXL-H組），含通心絡400 μg/mL的無血清ECM培養(yǎng)基預孵育4 h，換為含葡萄糖30 mmol/L加通心絡400 μg/mL的無血清ECM培養(yǎng)基。以上五組細胞處理完畢后置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進行指標檢測。

1.6 CCK-8法檢測HRCECs生存活性

接種于96孔細胞培養(yǎng)板的HRCECs按照“1.5”項處理后，吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入含CCK-8的無血清ECM培養(yǎng)基100 μL，放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h后，酶標儀檢測450 nm波長處OD值[8]。以各組OD值與normal組的比值行統(tǒng)計分析。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測HRCECs上清液中ET-1、IL-6和ICAM-1含量

接種于96孔細胞培養(yǎng)板的HRCECs按“1.5”項處理后，收集各組細胞上清液，1.5 mL無菌EP管中1000 r/min（r = 8.7 cm）離心2 min取上清液。ELISA法檢測各組細胞上清液中ET-1、IL-6和ICAM-1的含量，實驗中操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.8 Western blot法檢測eNOS和NF-κB蛋白表達

接種于直徑為6 cm細胞皿的HRCECs按“1.5”項處理后，培養(yǎng)皿內加入40 μL細胞裂解液于冰上充分裂解，超聲破碎后放入離心機內離心，收集上清液，蛋白定量后取等量蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉膜，封閉液中封閉，一抗孵育，二抗孵育，以GAPDH作為內參，將各目的蛋白吸光度值與GAPDH吸光度值的比值進行統(tǒng)計學分析。

1.9 統(tǒng)計學方法

所有數據采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，若方差齊時，采用最小顯著差法（LSD），若方差不齊，采用Dunnett′s T3法，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組人視網膜微血管內皮細胞生存活性和細胞上清液中ET-1、IL-6、ICAM-1含量比較

與normal組比較，model組細胞生存活性明顯降低，細胞上清液中ET-1、IL-6和ICAM-1含量明顯升高（P < 0.01）;與model組比較，TXL-L組、TXL-M組和TXL-H組細胞生存活性明顯升高，細胞上清液中IL-6和ICAM-1含量明顯降低，TXL-M組和TXL-H組細胞上清液中ET-1含量明顯降低（P < 0.01）。見表1。

2.2 各組人視網膜微血管內皮細胞eNOS和NF-κB蛋白表達比較

與normal組比較，model組細胞eNOS蛋白表達明顯下調，NF-κB蛋白表達明顯上調（P < 0.01）;與model組比較，TXL-L組、TXL-M組和TXL-H組細胞eNOS蛋白表達上調，NF-κB蛋白表達明顯下調（P < 0.05或P < 0.01）。見表2、圖1。

3 討論

DR是糖尿病最常見和嚴重的微血管并發(fā)癥之一，其基本的病理改變?yōu)槲⒀軆绕ぜ毎麚p傷、基底膜增厚、內皮細胞增生、新生血管形成等[9]，后期可形成微血栓甚至引起微血管閉塞[10]。這些微血管的病變屬于中醫(yī)“絡病”理論研究的范疇，治療上應以化瘀通絡為主，通心絡是在中醫(yī)絡病理論指導下組方而成，由人參、全蝎、水蛭、土鱉蟲、蟬蛻、蜈蚣、赤芍、酸棗仁等藥物組成，具有化瘀通絡、益氣活血等功效。實驗證實，通心絡具有降脂、抗炎、保護血管內皮細胞、抑制內皮細胞凋亡等作用[11-12]。已有動物實驗證實，通心絡對KK/Upj-Ay小鼠視網膜組織具有保護作用[13]，亦有臨床試驗表明通心絡治療DR效果確切。

本研究選用高糖誘導HRCECs損傷作為研究糖尿病視網膜微血管病變的模型，高糖能降低HRCECs的生存活性，TXL-L組、TXL-M組和TXL-H組均能升高HRCECs的生存活性，生存活性的提高是保證血管內皮細胞發(fā)揮正常功能的基礎條件，說明通心絡對糖尿病視網膜微血管病變具有一定的防治作用。一氧化氮（NO）對血管有保護作用，參與維持血管的正常張力，為內皮細胞合成的主要舒血管物質，它的前體是L-精氨酸，由一氧化氮合酶（NOS）催化合成，內皮細胞中存在的是eNOS，由于NO具有不穩(wěn)定性，故本研究檢測eNOS的蛋白表達以間接反映NO的含量。ET-1主要由內皮細胞合成和釋放，具有收縮血管的作用[14]。在生理狀態(tài)下，NO和ET-1的含量在局部保持動態(tài)平衡。本研究發(fā)現(xiàn)高糖誘導HRCECs后，細胞上清液中ET-1含量明顯升高，細胞eNOS蛋白表達明顯下調，說明NO和ET-1之間的平衡狀態(tài)被打破，內皮細胞功能受到了損傷，通心絡不同劑量干預后，細胞上清液中ET-1含量明顯降低，細胞eNOS蛋白表達明顯上調，且呈現(xiàn)劑量依賴性，提示通心絡對HRCECs的分泌功能起到了保護作用。

DR的發(fā)生機制與持續(xù)性高血糖、炎性反應、氧化應激、血管內皮細胞凋亡等因素相關，近年來研究發(fā)現(xiàn)，炎癥在DR的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要的作用，該觀點的提出為治療DR提供了新方向[15]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6、IL-1β和ICAM-1等多種炎癥因子之間的相互作用影響了DR的發(fā)展。IL-6作為前炎癥因子，在炎性反應中起著重要的作用[16]，ICAM-1是主要的黏附分子，在血管內皮細胞損傷過程中可釋放自由基、細胞因子，亦有研究顯示內皮細胞的損傷或死亡部分繼發(fā)于ICAM-1介導白細胞黏附于視網膜血管。NF-κB是細胞內調節(jié)炎癥信號轉導的關鍵因子之一，能夠調控包括IL-6和ICAM-1在內的多種炎性細胞因子的基因轉錄表達[17]。高糖、缺氧等均能激活NF-κB，活化的NF-κB可上調黏附分子的表達，使白細胞瘀滯、黏附于視網膜血管，引起一系列視網膜病變。本研究中，model組細胞上清液中IL-6和ICAM-1含量明顯升高，細胞NF-κB蛋白表達明顯上調，通心絡不同劑量干預后，細胞上清液中IL-6和ICAM-1含量明顯降低，細胞NF-κB蛋白表達明顯下調。提示通心絡能夠抑制高糖誘導HRCECs損傷炎性因子的高表達可能是通過抑制NF-κB途徑實現(xiàn)的。

高效液相色譜和氣相色譜的指紋圖譜技術已經證實，通心絡膠囊的主要成分為人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、芍藥苷、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B等。有研究表明，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1對內皮細胞具有顯著的保護作用[18-19]，而芍藥苷可減輕內皮細胞的炎性反應[20]。所以本研究推測，通心絡對HRCECs的功能受損和炎性反應的保護作用與此相關，但通心絡中是何成分起主要作用還需進一步研究。

綜上所述，高糖可誘導HRCECs發(fā)生功能障礙及炎性反應，通心絡可抑制該過程，其作用機制可能與通心絡抑制NF-κB介導的炎性反應有關。

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（收稿日期：2018-02-02 ?本文編輯：張瑜杰）