榆耳發(fā)酵產(chǎn)物的體外抑菌及免疫增強(qiáng)作用

邢效瑞，崔京春，郭海勇，錢愛東，楊閩楠

(1.西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川瀘州 646000；2.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600；3.吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林四平 136000；4.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118)

榆耳為肉紅膠韌革菌(Gloeostereumincarnatum)的子實(shí)體，又稱榆蘑[1-2]，是我國傳統(tǒng)的藥食兼用真菌，多生長在榆樹的枯樹干或樹洞處，主要分布于我國東北部地區(qū)及日本的北海道地區(qū)，在《本草綱目》[3]等書中多有記載，民間流傳使用榆耳水煎液治療紅白痢疾、腹瀉、腸炎等疾病。我國關(guān)于榆耳的研究起步較晚，主要集中在榆耳的分類分布、理化特性和生物學(xué)特征等方面。目前，液體深層發(fā)酵技術(shù)已成為藥用真菌資源開發(fā)的重要手段，具有廣泛的應(yīng)用價值。目前，國內(nèi)外的研究認(rèn)為，榆耳發(fā)酵上清液具有抑菌[4]、抗炎、抗氧化性、抗腫瘤、免疫增強(qiáng)[5]等多種生物學(xué)活性。本試驗(yàn)對榆耳G930菌種的發(fā)酵上清液體外抑菌效果及抑菌效果穩(wěn)定性、榆耳發(fā)酵液多糖的免疫增強(qiáng)作用進(jìn)行初步研究，以期為榆耳發(fā)酵產(chǎn)物的市場化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 榆耳G930菌種，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究中心提供；指示菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(EscherichiacoliATCC 25922)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、釀酒酵母桿菌(Saccharomycescerevisiae)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)，均由大連吉翔農(nóng)業(yè)科技有限公司研究中心提供；指示菌沙門氏菌(Salmonella)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)、大腸桿菌O24(EscherichiacoliO24)，均由西南醫(yī)科大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試驗(yàn)動物 6～8周齡SPF級BALB/c健康雌鼠、2～3 kg 成年健康豚鼠，均購自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 榆耳發(fā)酵培養(yǎng)基 榆耳發(fā)酵培養(yǎng)基由4.600%玉米淀粉、1.600%黃豆粉、0.010%磷酸氫二鉀、0.030%磷酸二氫鉀、0.001%硫酸錳、0.001%硫酸鋅、0.03%硫酸鎂、0.100 mg/mL 維生素B1組成，pH值為5.0～5.5，高壓蒸汽滅菌后，4 ℃分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3.2 各指示菌培養(yǎng)基 各指示菌培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[6]中所述方法及市場在售的培養(yǎng)基使用說明進(jìn)行配制，高壓蒸汽滅菌后，4 ℃分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3.3 馬鈴薯液體培養(yǎng)基 馬鈴薯液體培養(yǎng)基由20.00%馬鈴薯、2.00%葡萄糖、0.03%硫酸鎂、0.20%磷酸二氫鉀、10.00 mg/100 mL 維生素B1組成，pH值自然，高壓蒸汽滅菌后，4 ℃分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 主要試驗(yàn)試劑 注射用氨芐西林鈉(AMP)，購自哈爾濱制藥三廠；刀豆蛋白A(ConA)，購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)液，購自美國Gibco公司；雞紅細(xì)胞懸液、豚鼠血清、靈芝多糖溶液，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.5 主要試驗(yàn)儀器 紫外分光光度計，購自美國Unico公司；微量移液器，購自美國Thermo公司；超凈工作臺，購自北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，購自上海智誠分析儀器制造公司；光學(xué)顯微鏡，購自日本Olympus公司；臺式高速離心機(jī)，購自德國Osterode公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 榆耳發(fā)酵上清液的制備 將4 ℃保藏的榆耳G930斜面菌種接入已滅菌的馬鈴薯液體培養(yǎng)基中活化，于26 ℃、120 r/min搖床中恒溫培養(yǎng)10 d。活化后的榆耳菌種再按 10 % 的接種量接入已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于26 ℃、120 r/min 搖床中發(fā)酵培養(yǎng)7 d，制備得到榆耳發(fā)酵上清液。無菌條件下過濾后得到榆耳發(fā)酵上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 榆耳發(fā)酵上清液抑菌譜的測定及理化因素對其體外抑菌作用的影響

1.2.2.1 榆耳發(fā)酵上清液抑菌譜的測定 榆耳發(fā)酵上清液抑菌譜的測定試驗(yàn)采用杯碟法，將已經(jīng)制備好的指示菌懸液稀釋為1×106CFU/mL。制作指示菌培養(yǎng)基平板，將牛津杯(10 mm×8 mm×6 mm)平放在培養(yǎng)基上，在牛津杯中加入100 μL/孔試驗(yàn)樣品，同時設(shè)置AMP(10 μg/孔)和空白發(fā)酵培養(yǎng)基為對照組。37 ℃培養(yǎng)24 h后取出，測定抑菌圈的直徑。

1.2.2.2 榆耳發(fā)酵上清液的體外抑菌活性的熱穩(wěn)定性檢測 取適量的榆耳發(fā)酵上清液，分別測定其在-20、4、37、60、100、121 ℃及室溫(20～25 ℃)等溫度時的抑菌活性，發(fā)酵上清液在-20、4 ℃及室溫的條件下分別保存1周，其余溫度下保存10 min。采用杯碟法，以金黃色葡萄球菌為指示菌，以AMP(10 μg/孔)和空白發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照組進(jìn)行試驗(yàn)并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2.3 榆耳發(fā)酵上清液的體外抑菌活性的pH值穩(wěn)定性檢測 取適量榆耳發(fā)酵上清液，用1 mol/L磷酸和 1 mol/L 氫氧化鈉將榆耳發(fā)酵上清液的pH值分別調(diào)至1～9。采用杯碟法，以金黃色葡萄球菌作為指示菌，以AMP(10 μg/孔)和不同pH值的空白發(fā)酵培養(yǎng)基為對照組進(jìn)行試驗(yàn)并記錄數(shù)據(jù)。

1.3 榆耳發(fā)酵液多糖的免疫增強(qiáng)作用

1.3.1 榆耳發(fā)酵液多糖的粗提 將榆耳發(fā)酵上清液在60 ℃減壓蒸餾，10倍體積濃縮；使用乙醇沉淀法提取粗多糖后，再應(yīng)用Sevage法除蛋白，得到發(fā)酵液多糖溶液，采用苯酚硫酸法測定榆耳發(fā)酵液的多糖含量。

1.3.2 試驗(yàn)分組及給藥方式 6～8周齡SPF級BALB/c雌鼠小鼠100只，體質(zhì)量為(17±2)g，口服給藥，每天給藥1次，每次灌服劑量為0.2 mL/只，連續(xù)給藥21 d，禁食2 h開始試驗(yàn)。試驗(yàn)分組的詳細(xì)信息如表1所示。

表1 榆耳發(fā)酵液多糖的免疫增強(qiáng)作用試驗(yàn)分組

1.3.3 小鼠脾臟指數(shù)的測定 從各試驗(yàn)組中隨機(jī)選取5只小鼠，稱質(zhì)量，處死小鼠，無菌取脾臟后稱脾的質(zhì)量，計算脾臟指數(shù)，單位mg/g。脾臟指數(shù)=小鼠脾的質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量。

1.3.4 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的試驗(yàn) 從各試驗(yàn)組中隨機(jī)選取5只供試小鼠，腹腔注射1 mL 20%壓積雞紅細(xì)胞懸液，輕揉腹部。30 min后處死小鼠，向腹腔注射2 mL無菌生理鹽水，吸取1 mL腹腔洗液，滴3～4滴于載玻片上，37 ℃ 保濕溫育30 min后，瑞氏染液染色，油鏡下計數(shù)并計算腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)。吞噬率=吞噬紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)量/100×100%；吞噬指數(shù)=被100個巨噬細(xì)胞吞噬的紅細(xì)胞數(shù)量/100。

1.3.5 小鼠血清溶血素試驗(yàn) 在各試驗(yàn)組內(nèi)隨機(jī)選取10只小鼠，腹腔皮下注射1 mL 10%雞紅細(xì)胞懸液，3 d后眼球采血，制備小鼠血清；取1 mL稀釋100倍的小鼠血清加入5%雞紅細(xì)胞懸液中，再加0.1 mL 10%補(bǔ)體，以不加補(bǔ)體作空白對照，于37 ℃反應(yīng)30 min，冰水內(nèi)終止反應(yīng)，1 000 r/min離心5 min，在540 nm波長處測定吸光度并計算血清樣品的溶血素水平。樣品溶血素水平=樣品吸光度÷雞紅細(xì)胞半數(shù)溶血時的吸光度×稀釋倍數(shù)。

1.3.6 ConA誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(體內(nèi)法) 在各試驗(yàn)組內(nèi)隨機(jī)選取5只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.3 mg ConA，正常飼養(yǎng)3 d后，尾部取血法采集外周血，加入抗凝劑。取1小滴抗凝血涂片，自然干燥。瑞氏染液染色后，油鏡下觀察并計算淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)量/血液中總的淋巴細(xì)胞數(shù)量×100%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，利用SPSS 19.0軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗(yàn)平均值的成對二樣本分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 榆耳發(fā)酵上清液抑菌譜的測定及理化因素對其體外抑菌作用的影響

2.1.1 榆耳發(fā)酵上清液的抑菌譜 由表2可知，榆耳發(fā)酵上清液對金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性最強(qiáng)，抑菌直徑為18.5 mm；榆耳發(fā)酵上清液對枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的抑菌直徑分別為13.2、10.5 mm，對大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、大腸桿菌O24和沙門氏菌的抑菌直徑分別為11.7、9.5、11.0 mm，對肺炎克雷伯菌和多殺性巴氏桿菌的抑菌直徑分別為9.0、8.5 mm；榆耳發(fā)酵上清液對釀酒酵母菌無抑制作用。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，榆耳G930菌種的發(fā)酵上清液對革蘭氏陽性菌敏感，對革蘭氏陰性菌不敏感，對腸道致病菌的體外抑制作用強(qiáng)于對呼吸系統(tǒng)致病菌的體外抑制作用。

表2 榆耳發(fā)酵上清液體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

注：牛津杯外徑為8.0 mm，“-”表示樣品對指示菌無抑制作用；空白對照培養(yǎng)基對指示菌均無抑制作用。

2.1.2 溫度對榆耳發(fā)酵上清液體外抑菌作用的影響 AMP處理組的抑菌直徑為20.0 mm。由圖1可知，-20、4 ℃保存的榆耳發(fā)酵上清液與常溫保存的榆耳發(fā)酵上清液的體外抑菌活性沒有明顯差異，抑菌直徑均為18.0 mm。37 ℃保存的榆耳發(fā)酵上清液的抑菌直徑為17.5 mm。60、100 ℃保存的榆耳發(fā)酵上清液的抑菌直徑均為16.0 mm。經(jīng)過121 ℃高壓處理10 min的發(fā)酵上清液的抑菌活性稍有下降。結(jié)果表明，榆耳G930菌種的發(fā)酵上清液具有良好的熱穩(wěn)定性，易于保存。

2.1.3 pH值對榆耳發(fā)酵上清液體外抑菌作用的影響 當(dāng)pH值為1時，陰性對照組的抑菌直徑為14.0 mm，陽性對照組的抑菌直徑為20.5 mm。由圖2可知，當(dāng)榆耳發(fā)酵上清液的pH值為1時，其體外抑菌直徑最大，為26.0 mm；榆耳發(fā)酵上清液的pH值為2～7時，其抑菌直徑無明顯差異，為17.0～19.0 mm；當(dāng)榆耳發(fā)酵上清液的pH值為8時，其抑菌直徑為11.0 mm；當(dāng)榆耳發(fā)酵上清液的pH值為9時，其抑菌直徑為0，體外抑菌活性喪失。結(jié)果表明，榆耳G930菌種的發(fā)酵上清液在堿性環(huán)境中會失去體外抑菌活性。

2.2 榆耳發(fā)酵液多糖的免疫增強(qiáng)作用

2.2.1 小鼠脾臟指數(shù) 由表3可知，組2、組3小鼠的脾臟指數(shù)與陰性對照組小鼠的脾臟指數(shù)差異顯著(P<0.05)；組1小鼠的脾臟指數(shù)與陰性對照組小鼠的脾臟指數(shù)無顯著性差異，組2、組3小鼠的脾臟指數(shù)與陽性對照組小鼠的脾臟指數(shù)無顯著性差異。綜合考慮，飼喂小鼠榆耳G930菌種發(fā)酵上清液多糖的最佳劑量為5 mg/d，此時可以明顯增加小鼠的脾臟指數(shù)。

2.2.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn) 由表4可知，組1的吞噬率與陰性對照組的吞噬率差異顯著(P<0.05)，組2、組3的吞噬率與陰性對照組的吞噬率差異極顯著(P<0.01)。組1的吞噬指數(shù)與陰性對照組的吞噬指數(shù)差異顯著(P<0.05)，組2、組3的吞噬指數(shù)與陰性對照組的吞噬指數(shù)差異極顯著(P<0.01)。就吞噬率和吞噬指數(shù)而言，試驗(yàn)組與陽性對照組無顯著性差異，組2與組3無顯著性差異。綜合考慮，飼喂小鼠榆耳G930菌種發(fā)酵上清液多糖的最佳劑量為 5 mg/d，此時可以提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力，進(jìn)而提高機(jī)體的非特異性免疫水平。

表3 小鼠脾臟指數(shù)

注：“*”“**”分別表示與陰性對照組相比差異顯著(P<0.05)、差異極顯著(P<0.01)。下表同。

表4 巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 血清溶血素試驗(yàn) 由表5可知，3個試驗(yàn)組的溶血素水平與陰性對照組的溶血素水平相比均差異極顯著(P<0.01)，組2、組3的溶血素水平與陽性對照組的溶血素水平相比差異顯著(P<0.05)，試驗(yàn)組1與試驗(yàn)組2、組3差異顯著(P<0.05)，試驗(yàn)組2與試驗(yàn)組3無顯著性差異。結(jié)果表明，榆耳G930菌種發(fā)酵上清液多糖可以提高小鼠血清溶血素水平，進(jìn)而提高機(jī)體體液免疫水平。綜合考慮，確定榆耳發(fā)酵上清液多糖的最佳飼喂劑量為5 mg/d。

表5 血清溶血素試驗(yàn)

2.2.4 ConA誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(體內(nèi)法) 由表6可知，組1小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率與陰性對照組的無顯著性差異，組2、組3小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率與陰性對照組的差異顯著(P<0.05)，組2、組3小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率與陽性對照組的差異顯著(P<0.05)，組2與組3小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率無顯著性差異。結(jié)果表明，當(dāng)飼喂小鼠榆耳G930菌種發(fā)酵液多糖的劑量為5、10 mg/d時，可以提高小鼠細(xì)胞的免疫水平。綜合考慮，確定榆耳發(fā)酵上清液多糖的最佳飼喂劑量為5 mg/d。

表6 ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

3 結(jié)論與討論

3.1 榆耳發(fā)酵上清液抑菌譜的測定及理化因素對其體外抑菌作用的影響

人們一直認(rèn)為榆耳在治療腹瀉方面有其獨(dú)特的藥用價值，針對榆耳發(fā)酵上清液抑菌譜的研究一直不夠深入和系統(tǒng)。本研究選用畜禽生產(chǎn)中常見的致病菌及腸道益生菌作為指示菌，研究榆耳G930菌種液體發(fā)酵上清液的抑菌譜。結(jié)果表明，榆耳發(fā)酵上清液對革蘭氏陽性菌的體外抑制作用強(qiáng)于對革蘭氏陰性菌的體外抑制作用，與崔京春等的研究結(jié)果[7]一致，表明榆耳發(fā)酵上清液的體外抑菌作用在不同種屬之間差異不明顯。同時也發(fā)現(xiàn)，榆耳發(fā)酵上清液對腸道致病菌的抑制作用強(qiáng)于對呼吸系統(tǒng)致病菌的抑制作用，民間常用榆耳水煎液治療痢疾，其發(fā)酵上清液中可能含有作用于腸道致病菌的抑菌物質(zhì)。對榆耳發(fā)酵上清液進(jìn)行理化處理后發(fā)現(xiàn)，榆耳發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性和耐酸性，表明其易于保存并可以通過動物的消化系統(tǒng)到達(dá)機(jī)體作用的部位。以上結(jié)論充分表明，榆耳發(fā)酵產(chǎn)物具有作為治療動物腹瀉藥物進(jìn)行開發(fā)的巨大潛力。本試驗(yàn)僅對榆耳發(fā)酵產(chǎn)物的體外抑菌作用進(jìn)行了初步研究，未來可以從發(fā)酵產(chǎn)物中抑菌物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、作用位點(diǎn)及抑菌機(jī)制等方面進(jìn)行深入研究。

3.2 榆耳發(fā)酵液多糖對小鼠免疫器官及免疫功能的影響

脾臟是人和脊椎動物體內(nèi)最大的免疫器官，是免疫系統(tǒng)產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞和抗體的重要場所。試驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂小鼠榆耳發(fā)酵液多糖的劑量為5、10 mg/d，并連續(xù)飼喂21 d，可顯著增加正常小鼠的脾臟指數(shù)。劉瑞君等研究認(rèn)為，榆耳多糖可增加小鼠中樞免疫器官胸腺與脾臟指數(shù)[8]，本試驗(yàn)的結(jié)果與之基本一致，但這與崔京春等的研究結(jié)果[9]不一致。榆耳發(fā)酵液多糖對小鼠免疫器官的影響程度可能與飼喂時間的長短有關(guān)。本試驗(yàn)通過腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)、血清中溶血素水平測定試驗(yàn)及ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，分別評價榆耳發(fā)酵液多糖對小鼠非特異性免疫、體液免疫及細(xì)胞免疫功能[10]的影響。結(jié)果表明，榆耳發(fā)酵液多糖溶液對腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響呈一定的量效關(guān)系，榆耳發(fā)酵液多糖中、高劑量組的作用明顯高于低劑量組，表明榆耳發(fā)酵上清液多糖對巨噬細(xì)胞吞噬功能和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響可隨濃度的升高而增強(qiáng)，但中、高劑量組之間無顯著性差異，表明榆耳發(fā)酵上清液多糖的最佳劑量在為5 mg/d。同時試驗(yàn)結(jié)果表明，榆耳發(fā)酵上清液多糖可顯著提高小鼠外周血中血清溶血素水平，增加特異性抗體含量，繼而增強(qiáng)小鼠體液免疫功能，無明顯的量效關(guān)系，榆耳發(fā)酵上清液多糖的最適劑量為5 mg/d，小鼠平均體質(zhì)量按20 g計算，榆耳發(fā)酵上清液多糖對小鼠免疫增強(qiáng)作用的有效作用劑量為 250 mg/(kg·d)。侯建明等研究發(fā)現(xiàn)，銀耳多糖的劑量在500～2 000 mg/(kg·d)范圍內(nèi)可顯著提高小鼠血清溶血素水平[11]，本試驗(yàn)結(jié)果與之相似。根據(jù)文獻(xiàn)報道，桑葉多糖等可以促進(jìn)ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)[12]。綜上所述，榆耳發(fā)酵上清液多糖可以提高小鼠細(xì)胞免疫功能。

本研究以榆耳G930菌種發(fā)酵上清液及發(fā)酵上清液多糖為研究對象，對榆耳發(fā)酵產(chǎn)物的體外抑菌及免疫增強(qiáng)作用進(jìn)行研究。結(jié)果表明，榆耳發(fā)酵上清液具有較寬的抑菌譜和良好的耐酸性、耐熱性；榆耳發(fā)酵上清液多糖飼喂量為250 mg/(kg·d)時，可以提高小鼠的非特異性免疫功能、體液免疫功能和細(xì)胞免疫功能。表明榆耳發(fā)酵產(chǎn)物可作為動物疾病治療藥物及動物保健產(chǎn)品，發(fā)揮抗菌和增強(qiáng)動物機(jī)體免疫力的功效，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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