繆錦浩，郭海玲，房 雷，陳 羽，匡 勇

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院骨傷科，上海 201203

頸椎后縱韌帶骨化癥（OPLL）可產(chǎn)生對脊髓、神經(jīng)根的壓迫，并出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能障礙。其病理基礎(chǔ)是后縱韌帶的成纖維細胞出現(xiàn)骨向分化，并在患者的后縱韌帶組織內(nèi)出現(xiàn)異位骨化。牽張應(yīng)力刺激可使后縱韌帶成纖維細胞表現(xiàn)出一定的成骨細胞活性，被認為是促進頸椎OPLL進展的重要因素，但其機制尚不明了［1-4］。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）可增加成纖維細胞的膠原合成，促進細胞外基質(zhì)沉積，而這也正是成纖維細胞出現(xiàn)骨向分化進程中的表現(xiàn)［5-7］。因此，推測牽張應(yīng)力刺激可能對后縱韌帶細胞中的TGF-β1表達有所影響，并借此促進其骨化。本研究通過對體外培養(yǎng)的頸椎OPLL患者的后縱韌帶成纖維細胞加載牽張應(yīng)力刺激，觀察其骨化指標和TGF-β1基因的表達變化，研究TGF-β1在該進程中的作用，從而證實以上推論。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

收集本院12例接受頸前路手術(shù)的頸椎OPLL患者的后縱韌帶組織，其中男7例，女5例；平均年齡52.1（38 ～ 62）歲。實驗所用主要試劑及設(shè)備如下。DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司，中國），TRIzol細胞RNA抽提用裂解液、大容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Life Technologies公司，美國），SYBR Primix Ex Taq II PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本），總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京），外源性TGF-β1（Humanzyme公司，美國），TGF-β1抗體、IgG（Epitomics公司，美國），ABI 7500 RT-PCR擴增儀、ABI 2720 cDNA反轉(zhuǎn)錄儀（Life Technologies公司，美國），核酸蛋白測定儀（Eppendorf公司，美國），細胞牽張應(yīng)力加載儀（Flexercell公司，美國）。

1.2 細胞培養(yǎng)及鑒定

將所取標本剪成小于0.5 cm×1.0 cm×1.0 cm的小塊組織，將其均勻鋪灑于50 mL細胞培養(yǎng)瓶中，靜置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，采用組織塊培養(yǎng)法進行體外培養(yǎng)。待組織塊周圍細胞爬出后，每3 ～ 5 d更換一次培養(yǎng)液，待細胞鋪滿瓶底約80%后，加入0.5 ～ 1.0 mL 0.25%胰酶-EDTA液進行消化傳代。取第3代細胞用于實驗。將細胞接種在培養(yǎng)板內(nèi)的蓋玻片上，置入培養(yǎng)箱內(nèi)過夜，待細胞貼壁。次日對細胞進行HE及免疫熒光染色鑒定，熒光倒置相差顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)特點。

1.3 分組及對照設(shè)計

按照3×105/孔的密度將細胞接種在特制的Flexercell培養(yǎng)板內(nèi)。取2塊培養(yǎng)板分別加載牽張應(yīng)力刺激12 h及24 h，并分別設(shè)靜置相同時間的對照組。另取2塊培養(yǎng)板接種細胞，并在其中一塊的培養(yǎng)孔中分別依次加入濃度為0、0.1、1.0、10.0 ng/mL的外源性TGF-β1（濃度為0視為對照組），靜置24 h；在另一塊培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中接種細胞并加入濃度為2.0 μg/mL的TGF-β1抗體，并設(shè)空白對照組，同時選擇對TGF-β1表達沒有影響但結(jié)構(gòu)相似的IgG以相同濃度設(shè)為參照組，各組均加載牽張應(yīng)力刺激24 h。所有實驗重復(fù)2次。

1.4 牽張應(yīng)力加載

確保培養(yǎng)板底部硅膠膜處于水平位置后，將其放入培養(yǎng)箱過夜待細胞貼壁。次日在電子顯微鏡下確認細胞的貼壁及生長狀態(tài)良好后，更換培養(yǎng)液同步化24 h，以確保細胞的生長狀態(tài)一致。同步化完成后將培養(yǎng)板再次放入培養(yǎng)箱，開啟計算機控制中心，連接負壓抽吸泵，設(shè)置牽張應(yīng)力參數(shù)，幅度10%、頻率0.5 Hz，作用時間為12 h及24 h。

1.5 骨化指標和TGF-β1的檢測

按上述分組，采用TRIzol法收集各培養(yǎng)孔中細胞的總RNA，通過核酸蛋白光譜儀測定其純度和濃度。設(shè)計合成RNA引物，引物序列見表1。使用大容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，隨后進行熒光實時定量PCR，選擇相對定量分析法進行分析，以β-actin作為內(nèi)標基因，研究相關(guān)基因的相對表達差異。

表1 PCR引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 后縱韌帶細胞的HE及免疫熒光染色鑒定

經(jīng)HE及免疫熒光染色后，在倒置相差顯微鏡下觀察，來源于頸椎OPLL患者的后縱韌帶成纖維細胞呈梭形、紡錘形及多角的星形，細胞核大、卵圓形，部分細胞處于有絲分裂期。細胞核經(jīng)DAPI染為藍色，細胞質(zhì)波形蛋白經(jīng)TRITC標記后呈紅色陽性表達，可證實其為成纖維細胞（圖1）。

2.2 牽張應(yīng)力刺激后COLⅠ、ALP和TGF-β1表達

來源于頸椎OPLL患者的后縱韌帶成纖維細胞經(jīng)牽張應(yīng)力刺激12 h及24 h后，細胞中COLⅠ、ALP和TGF-β1的mRNA表達與靜置相同時間的對照組相比均有所升高，在24 h時其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05，圖2）。

圖1 后縱韌帶成纖維細胞Fig. 1 Posterior longitudinal ligament fi broblasts

圖 2 牽張應(yīng)力刺激12 h及24 h后COLⅠ、ALP和TGF-β1的mRNA表達Fig. 2 mRNA expression of COLⅠ，ALP and TGF-β1 after 12 h and 24 h stress stimulation

2.3 TGF-β1在后縱韌帶成纖維細胞骨化進程中的作用

在接種后縱韌帶細胞的培養(yǎng)孔中加入濃度分別為0、0.1、1.0、10.0 ng/mL的外源性TGF-β1，靜置24 h后，細胞中COLⅠ及ALP的mRNA表達量升高，其中10.0 ng/mL濃度組與0 ng/mL組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05，圖3）。而經(jīng)牽張應(yīng)力刺激24 h后，對照組及IgG組細胞中COLⅠ及ALP的mRNA表達量升高幅度均明顯大于TGF-β1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05，圖4）。

3 討 論

OPLL的發(fā)生和發(fā)展被認為與牽張應(yīng)力刺激關(guān)系密切。日本學(xué)者在分析了頸椎的活動度與骨化進展快慢之間的關(guān)系后認為，頸椎活動度較小的患者骨化進展的速度相對較慢，反之則較快［8-9］。也有學(xué)者研究證實，在頸椎OPLL患者中，頸椎活動度越大的節(jié)段韌帶骨化的程度往往越嚴重［10-11］。在臨床隨訪中，也發(fā)現(xiàn)接受頸椎后路椎板切除或椎管成形術(shù)等后路術(shù)式的患者由于頸椎后方結(jié)構(gòu)被破壞，可能產(chǎn)生頸椎不穩(wěn)而導(dǎo)致后縱韌帶的骨化灶進展加速；而接受前路融合術(shù)的患者，因為融合后去除了頸椎節(jié)段間的不穩(wěn)因素，其后縱韌帶的骨化灶進展明顯減慢，甚至完全消失［12-14］。因此，牽張應(yīng)力刺激被認為是促進頸椎OPLL進展的重要因素。

圖3 TGF-β1作用24 h 后COLⅠ和ALP的mRNA表達Fig. 3 mRNA expressions of COLⅠand ALP after stimulation with TGF-β1 for 24 h

圖4 TGF-β1抗體作用并機械應(yīng)力刺激24 h后COLⅠ和ALP的mRNA表達Fig. 4 mRNA expressions of COLⅠand ALP after 2 μg/mL TGF-β1 antibody plus 24 h stress stimulation

由于OPLL起病過程緩慢，病因復(fù)雜，致病因素多，尚沒有建立理想的活體動物模型，多采用動物或者人體的后縱韌帶組織進行體外研究。本研究通過頸前路手術(shù)獲取頸椎OPLL患者的后縱韌帶標本，并采取組織塊培養(yǎng)法進行細胞體外培養(yǎng)。對培養(yǎng)成功的細胞加載機械牽張應(yīng)力刺激的原理是利用真空泵抽吸特制的細胞培養(yǎng)板底部硅膠模，形成負壓，使細胞受到機械牽張，模擬體內(nèi)后縱韌帶承受的機械應(yīng)力刺激。針對人頸椎活動的特點，本研究將牽張應(yīng)力刺激的參數(shù)設(shè)置在低頻率、低幅度狀態(tài)，以更符合生理狀態(tài)，而且也避免了過高頻率或過高幅度對體外培養(yǎng)的韌帶細胞可能造成的損傷。

選擇合適的成骨化指標是觀察牽張應(yīng)力刺激對成纖維細胞骨化進程的影響，并進一步深入研究頸椎OPLL發(fā)生、發(fā)展過程的前提。COLⅠ是不溶性纖維型蛋白質(zhì)，屬于一類細胞外基質(zhì)，COLⅠ含量的增加會使韌帶纖維化的程度增高，其分泌增多是骨基質(zhì)形成的特征性表現(xiàn)［15］。ALP通過水解有機磷酸酯能為羥基磷灰石沉積提供必需的磷酸基團，利于細胞骨化，是骨形成過程中礦化階段的極好標志物，定量ALP可作為成骨活性的可靠指標［16］。因此本研究選擇了COLⅠ和ALP作為觀察成纖維細胞骨化進程的特異性指標。實驗結(jié)果證實牽張應(yīng)力刺激可促進頸椎OPLL患者后縱韌帶成纖維細胞的成骨化指標升高，加速其骨向分化，同時亦發(fā)現(xiàn)在該進程中TGF-β1的表達有明顯上調(diào)。TGF-β1與頸椎OPLL關(guān)系密切，可增加成纖維細胞膠原蛋白合成，促進細胞外基質(zhì)沉積。Li等［17］通過實驗發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖可促進大鼠后縱韌帶細胞分泌TGF-β1，并使膠原蛋白表達升高，促進骨化，而采用抗體中和TGF-β1作用后，高濃度葡萄糖對大鼠后縱韌帶細胞骨化的促進作用減弱，從而證實TGF-β1在高糖促進OPLL進程中的作用。在本實驗中，加入外源性的TGF-β1作用后，頸椎OPLL患者的后縱韌帶成纖維細胞即使在無應(yīng)力刺激時其骨化指標表達亦明顯升高，且呈現(xiàn)出一定的濃度依賴作用；同時，在加入TGF-β1抗體中和其作用后，應(yīng)力刺激對后縱韌帶成纖維細胞骨化指標表達的促進作用明顯減弱。因此可認為TGF-β1在外界的牽張應(yīng)力刺激傳導(dǎo)至后縱韌帶成纖維細胞內(nèi)并促進其骨向分化的過程中具有重要作用。

本研究克服了以往頸椎OPLL患者的后縱韌帶標本為退變的病理組織、生長分化能力弱、體外培養(yǎng)成活率低的困難，采用組織塊培養(yǎng)法成功培養(yǎng)了頸椎OPLL患者的后縱韌帶成纖維細胞。證實了TGF-β1在牽張應(yīng)力刺激促進頸椎OPLL患者后縱韌帶成纖維細胞骨向分化進程中的作用。

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