張超　周業(yè)　謝黎明

摘 要：目的 了解RTN4蛋白在胃癌發(fā)病過程中的作用，為揭示胃癌發(fā)病的分子機制提供實驗資料。方法 將pIRESneo3-RTN4真核表達載體轉(zhuǎn)染胃粘膜上皮GES1細胞，建立RTN4高表達的GES1-RTN4細胞系；通過細胞生長曲線、平皿克隆與軟瓊脂集落形成實驗、流式細胞儀，觀察RTN4高表達對GES1細胞生長與增殖、周期與凋亡的影響；利用Western-blot檢測GES1-RTN4細胞中IκBα蛋白的表達。結(jié)果 GES1-RTN4細胞的生長速度較GES1和GES1-pIRESneo3細胞加快，統(tǒng)計學意義顯著（P<0.01）；GES1-RTN4細胞較GES1和GES1-pIRESneo3細胞克隆體積大、數(shù)目多，統(tǒng)計學意義顯著（P<0.01）；GES1-RTN4細胞中S期細胞比例較GES1和GES1-pIRESneo3細胞增加，細胞增殖指數(shù)增加，細胞凋亡率降低，統(tǒng)計學意義顯著（P<0.01）；GES1-RTN4細胞中IκBα蛋白表達較GES1和GES1-pIRESneo3細胞減少，統(tǒng)計學意義顯著（P<0.01）。結(jié)論 RTN4通過活化NF-κB信號通路，提高細胞增殖指數(shù)，抑制細胞凋亡，促進GES1細胞的增殖。

關(guān)鍵詞：GES1細胞；RTN4蛋白；細胞增殖；NF-κB信號通路

中圖分類號：R735.2 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.22.016

文章編號：1006-1959（2018）22-0055-05

The Role of RTN4 in the Pathogenesis of Gastric Carcinoma

ZHANG Chao1，2，ZHOU Ye1，XIE Li-min3，HE Xiu-sheng1，ZHANG Zhi-wei1

（1.Hunan Provincial Key Laboratory of Tumor Cell and Molecular Pathology，Cancer Research Institute，School of Medicine，Nanhua University，Hengyang 421001，Hunan，China；

2.Department of Dermatology，Nanhua Hospital，Nanhua University，Hengyang 421001，Hunan，China；

3.the First Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang 421001，Hunan，China）

Abstract： Objective To investigate the role of RTN4 protein in the pathogenesis of gastric carcinoma and to provide experimental data for revealing the molecular mechanism of gastric carcinoma.Methods The pIRESneo3-RTN4 eukaryotic expression vector was transfected into gastric mucosal epithelial GES1 cells to establish a high expression of GES1-RTN4 cell line. The cell growth curve， plate clone and soft agar colony formation assay， flow cytometry， high RTN4 expression were observed. The effects of GES1 cell growth and proliferation， cycle and apoptosis were detected by Western-blot. The expression of IκBα protein in GES1-RTN4 cells was detected by Western-blot. Results The growth rate of GES1-RTN4 cells was faster than that of GES1 and GES1-pIRESneo3 cells， which was statistically significant（P<0.01）. The GES1-RTN4 cells were larger and more numerous than GES1 and GES1-pIRESneo3 cells，the statistical significance was significant（P<0.01）； the proportion of S phase cells in GES1-RTN4 cells was higher than that of GES1 and GES1-pIRESneo3 cells， the cell proliferation index increased， and the apoptosis rate decreased， statistically significant（P<0.01）；The expression of IκBα protein in GES1-RTN4 cells was significantly lower than that in GES1 and GES1-pIRESneo3 cells，statistically significant（P<0.01）. Conclusion RTN4 can increase the cell proliferation index， inhibit cell apoptosis and promote the proliferation of GES1 cells by activating NF-κB signaling pathway.

Key words：GES1 cells；RTN4 protein；Cell proliferation；NF-κB signaling pathway

胃癌（gastric carcinoma，GC）是我國常見的十大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率居第2位，消化道腫瘤的第1位[1，2]?，F(xiàn)今，胃癌在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年下降與年輕化的趨勢，但仍然嚴重危害人們健康與生命[3]，其發(fā)病的分子機制仍不十分清楚。本課題組前期采用定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)鑒定了243個胃癌相關(guān)蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)RTN4蛋白在胃粘膜癌變過程中表達上調(diào)[4]，但其在胃癌發(fā)病過程中的具體作用及機制仍不清楚，深入了解其在胃癌發(fā)病中的作用，將為闡明胃癌發(fā)病的分子機制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系和質(zhì)粒 永生化胃粘膜上皮GES1細胞購自上海中國醫(yī)學科學院細胞生物研究所，用10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。pIRESneo3-RTN4真核表達載體購自長沙佳和生物科技有限公司。

1.1.2引物 根據(jù)RTN4基因序列，采用Premier 6.0軟件設(shè)計重組RTN4和β-actin內(nèi)對照引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成RTN4引物（5'-AAAGATATCAAATATGGACTTGAA-3'；5-AAAGGATCCCTGACCCTCCC CCGTA-3'，大小2961 bp）與β-actin引物（5'-TCTACAATGAGCTGCGTGTGG-3'；5'-GGAACCGCTCATTGCCAATG-3'，大小498 bp）

1.1.3主要試劑 高保真酶、T4 DNA Ligand merase、Reverse transcription system試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，限制性內(nèi)切酶HindIII和XhoI購自 Fermentas公司，一抗與二抗購自Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1細胞免疫熒光 將細胞以每孔3×105個接種于6孔板中，制作細胞爬片，固定、PBS洗滌，1∶1000鼠抗人RTN4單抗37 ℃孵育1 h，PBS洗滌，1∶2000 FITC標記羊抗鼠二抗37 ℃孵育1 h，PBS洗滌，封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 Western-blot檢測 收集細胞，提取總蛋白質(zhì)測定濃度，10%不連續(xù)SDS聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫孵育封閉，1∶1000鼠抗人RTN4或IκBα單抗與1∶2000抗β-actin單抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，1∶1000辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜，發(fā)光、曝光、顯影與定影。掃描蛋白質(zhì)條帶灰度分析，細胞中RTN4或IκBα蛋白的表達。

1.2.3 MTT比色法 將細胞以每孔5×103個接種于96孔板中，每組設(shè)3個平行孔，培養(yǎng)24 h，每孔加入5 mg/μl MTT 20 μl，培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μl DMSO，溶解后置于酶標儀中，測定每孔的吸光度值（OD值），重復檢測細胞1次/d，每次重復3次，取平均值，將每次測量值與第1的測量值之商進行校正，代表檢測細胞生長的測量值，連續(xù)重復7 d，將校正測量值繪制于坐標紙上，繪制細的生長曲線。

1.2.4平皿克隆形成實驗 將細胞以每孔1000個細胞接種于6孔板中，每組設(shè)3平行孔，靜置培養(yǎng)1周后，固定、結(jié)晶紫染色，肉眼計數(shù)細胞形成的克隆數(shù)，或顯微鏡下計數(shù)>50個細胞的克隆數(shù)，計算克隆形成率：克隆形成率（%）=（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%。

1.2.5軟瓊脂集落形成實驗 制備終濃度0.6%底層瓊脂，冷卻后；制備終濃度0.3 %頂層瓊脂（含細胞 1×104個/孔），鋪于底層瓊脂上，每組細胞設(shè)3個平行孔，連續(xù)培養(yǎng)2周后。顯微鏡下觀察集落（≥50個細胞為1個集落）的數(shù)目和大小，每組隨機選擇10個不同的低倍視野，計數(shù)集落數(shù)，重復計數(shù)3次，取平均值，計算細胞集落形成率=集落數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.2.6流式細胞儀（FCM）檢測 收集細胞，調(diào)整密度為1×106 個/μl，4 ℃，70 %乙醇固定，PBS洗滌，含RNA酶Tris-HCl液37 ℃孵育30 min，加入50 mg/L碘化丙錠染色，送公司進行流式細胞儀檢測，分析細胞周期與細胞的凋亡率，計算細胞增殖指數(shù)（PI）=（S+G2）/（G0/G1+S+G2）。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，組間比較采用q檢驗，三組以上比較采用單因素方差分析（One way ANOVA），以P<0.01表示統(tǒng)計學意義顯著。

2結(jié)果

2.1建立RTN4高表達的GES1細胞系 將pIRESneo3-RTN4質(zhì)粒（pIRESneo3為對照載體）轉(zhuǎn)染GES1細胞，G418篩選后，建立RTN4穩(wěn)定高表達GES1細胞（GES1-RTN4），免疫熒光與Western-blot檢測RTN4表達，結(jié)果顯示GES1-RTN4細胞中RTN4蛋白表達水平升高，見圖1、圖2。

2.2 RTN4高表達對GES1細胞生長的影響 采用MTT法檢測GES1-RTN4細胞的生長情況。結(jié)果顯示，GES1-RTN4細胞的生長速度顯著快于GES1和GES1-pIRESneo3細胞，見圖3。提示RTN4高表達后GES1細胞生長加快，增殖能力增強。

2.3 RTN4高表達對GES1細胞克隆形成的影響 平皿克隆實驗結(jié)果顯示，GES1-RTN4細胞形成的克隆數(shù)多，克隆形成率明顯高于GES1和GES1-pIRESneo3細胞（P<0.01），見表1。提示RTN4高表達后，GES1細胞增殖能力增強。

2.4 RTN4高表達對GES1細胞集落形成的影響 軟瓊脂形成集落實驗結(jié)果顯示，GES1-RTN4細胞形成的集落較GES1和GES1-pIRESneo3細胞大，數(shù)目多，集落形成率高（P<0.01），見表2。說明RTN4高表達后，GES1細胞增殖能力增強。

2.5 RTN4高表達對GES1細胞周期分布的影響 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，GES1-RTN4細胞群中G0/G1期較GES1和GES1-pIRESneo3細胞減少，而S期則增加，細胞增殖指數(shù)增高（P<0.01），見表3。說明RTN4高表達后，提高GES1細胞增殖指數(shù)而促進細胞的增殖。

2.6 RTN4高表達對GES1細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，GES1-RTN4細胞的凋亡率（17.52±1.23）低于GES1（24.65±4.58）和GES1-pIRESneo3（24.43±3.36）細胞（P<0.01）。說明RTN4高表達后抑制GES1細胞的凋亡。

2.7 Western blot檢測RTN4高表達對NF-κB信號通路的影響 GES1-RTN4細胞中IκBα蛋白的表達明顯低于GES1和GES1-pIRESneo3細胞（P<0.01），見圖4。說明RTN4高表達后可以誘導GES1細胞中NF-κB信號通路的活化。

3討論

胃癌的發(fā)生與遺傳因素密不可分，涉及癌基因的激活與抑癌基因的失活[5]，如C-met基因、K-sam基因、C-erbB2基因、K-ras基因、C-myc基因、p53基因、p27 基因和p16基因等。分子遺傳學變化與病理學特征、胃癌生物學行為及患者預后間關(guān)系十分密切。了解相關(guān)基因調(diào)節(jié)分子的機制，可為闡明胃癌的發(fā)病機理，臨床診斷與治療等提供十分有利證據(jù)。

RTN4蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺、腎臟、骨骼肌、肺、肝與胃腸道等組織廣泛表達。有研究證實在肝癌組織中，低氧可誘導RTN4高表達，促進血管生成，加速瘤體生長[6]。缺氧微環(huán)境能夠促進缺氧誘導因子HIF-lα和AP-1因子產(chǎn)生，促血管生成因子RTN4表達增加，導致腫瘤組織血管生成，加速腫瘤生長[7]。也有研究證實RTN4在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達，其表達較癌旁對照組織明顯升高，結(jié)果提示該蛋白在腫瘤中可能發(fā)揮促進腫瘤細胞增殖的作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)RTN4 高表達后，GES1細胞的增殖能力增加，增殖指數(shù)升高，細胞凋亡率降低，提示其可能具有一定的促進細胞惡變的功能。

核因子κB（NF-κB）信號通路在細胞中作用重要，控制調(diào)節(jié)增殖、細胞凋亡逃避和血管生成等，其活性受IκBs抑制蛋白調(diào)節(jié)[9，10]。NF-κB與IκBs蛋白相互結(jié)合后遮蔽核轉(zhuǎn)位信號區(qū)，NF-κB位于細胞內(nèi)不能入核，抑制其轉(zhuǎn)錄活性[11]。IκBα是IκBS中研究最多者，其在細胞內(nèi)通過快速磷酸化或降解后，使NF-κB分離后入核，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達[12]。本文發(fā)現(xiàn)RTN4蛋白在GES1細胞中高表達后，細胞增殖能力增強，且IκBα蛋白表達降低，提示RTN4在GES1細胞內(nèi)可能通過促進NF-κB信號通路活化，抑制細胞凋亡，提高細胞增殖指數(shù)，誘導細胞增殖。因細胞內(nèi)NF-κB信號通路調(diào)節(jié)機制復雜，RTN4如何具體參與NF-κB信號通路的活化仍有待深入研究。

綜上所述，本文初步發(fā)現(xiàn)RTN4高表達后可促進GES1細胞增殖，抑制細胞凋亡，其可能啟動了NF-κB信號通路的活化，為進一步研究RTN4在GES1細胞增殖中的作用及機制提供了思路，也為闡明胃癌發(fā)病的分子機制提供了理論依據(jù)。

參考文獻：

[1]Sitarz R，Skierucha M，Mielko J，et al.Gastric cancer： epidemiology， prevention， classification， and treatment[J].Cancer Manag Res，2018（10）：239-248.

[2]Chen W，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer statistics in China，2015[J].CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132.

[3]Wang Y，Zhao X，Song Y，et al.A systematic review and meta-analysis of robot-assisted versus laparoscopically assisted gastrectomy for gastric cancer [J].Medicine （Baltimore）. 2017，96（48）：e8797.

[4]張志偉.胃粘膜上皮癌變相關(guān)蛋白質(zhì)分子的篩選與鑒定[D]. 南華大學，2015.

[5]Figueiredo C，Camargo MC， Leite M， et al. Pathogenesis of Gastric Cancer： Genetics and Molecular Classification[J]. Curr Top Microbiol Immunol，2017（400）：277-304.

[6]Wang N，Chen K，Xu J，et al.Association of CAA and TATC Insertion/Deletion Genetic Polymorphisms in RTN4 3'-UTR with Hepatocellular Carcinoma Risk[J].Pathol Oncol Res，2018，24（1）：31-34.

[7]Babur O，Ngo ATP，Rigg RA，et al.Platelet procoagulant phenotype is modulated by a p38-MK2 axis regulating RTN4/Nogo proximal to the endoplasmic reticulum： utility of pathway analysis[J].Am J Physiol Cell Physiol，2018，314（5）：C603-C615.

[8]Chi C，Liu N，Yue L，et al.RTN4/Nogo is an independent prognostic marker for gastric cancer： preliminary results[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2015，19（2）：241-246.

[9]Colomer C，Marruecos L，Vert A，et al.NF-κB Members Left Home： NF-κB-Independent Roles in Cancer [J].Biomedicines，2017，5（2）：E26.

[10]Soubannier V，Stifani S.NF-κB Signalling in Glioblastoma[J].Biomedicines，2017，5（2）：E29.

[11]Ziembik MA，Bender TP，Larner JM，et al.Functions of protein phosphatase-6 in NF-κB signaling and in lymphocytes[J].Biochem Soc Trans，2017，45（3）：693-701.

[12]Yu L，Li L，Medeiros LJ，et al.NF-κB signaling pathway and its potential as a target for therapy in lymphoid neoplasms[J].Blood Rev，2017，31（2）：77-92.

收稿日期：2018-8-20；修回日期：2018-9-7

編輯/肖婷婷