CyclinA2基因多態(tài)性與肝細(xì)胞肝癌易感性的關(guān)系

袁國(guó)輝　戴超　吳兆平

摘 要：目的 探討CyclinA2啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸多態(tài)性與肝細(xì)胞肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。方法 選取2012年10月～2017年9月在九江市第一人民醫(yī)院確診的原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌患者180例，同時(shí)選擇行體檢的健康志愿者180例作為對(duì)照組。分別采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法對(duì)cyclinA2基因的rs769236位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，比較不同基因型與原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。結(jié)果 rs769236 等位基因A（GA+AA）攜帶者患原發(fā)性肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于rs769236GG野生基因型的個(gè)體（校正OR=1.825，95%CI=1.133-2.940）。結(jié)論 CyclinA2基因rs769236（G/A）位點(diǎn)A變異可能會(huì)增加原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞肝癌；CyclinA2；單核苷酸多態(tài)性

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.22.021

文章編號(hào)：1006-1959（2018）22-0077-04

Relationship between Polymorphism of CyclinA2 Gene and Susceptibility to Hepatocellular Carcinoma

YUAN Guo-hui，DAI Chao，WU Zhao-ping，CHEN Wei-li，MEI Bao-hua

（Department of Hepatobiliary Surgery，the First People's Hospital of Jiujiang，Jiujiang 332000，Jiangxi，China）

Abstract：Objective To investigate the relationship between cyclinA2 promoter single nucleotide polymorphism （SNP） and the risk of hepatocellular carcinoma.Methods From October 2012 to September 2017， 180 patients with primary hepatocellular carcinoma diagnosed in the First People's Hospital of Jiujiang city were selected，at the same time， 180 healthy volunteers were selected as control group.Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP） was used to detect the rs769236 locus of cyclinA2 gene and compare the relationship between different genotypes and the risk of primary hepatocellular carcinoma.Results The risk of rs769236 allele A （GA+AA） carriers with primary hepatocellular carcinoma was significantly higher than that of the rs769236GG wild genotype （corrected OR=1.825， 95% CI=1.133-2.940）. Conclusion CyclinA2 gene rs769236 （G/A） site A mutation may increase the risk of primary hepatocellular carcinoma.

Key words：Hepatocellular carcinoma；CyclinA2；Single nucleotide polymorphism

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)每年新增患病人數(shù)超過(guò)62萬(wàn)人次，且1年生存率還不足50%[1]，其發(fā)病率及死亡率分別占第5位和第3位[2，3]，我國(guó)是肝細(xì)胞癌的高發(fā)地區(qū)之一，占全球新發(fā)病例的56%[4]。流行病學(xué)研究表明，肝細(xì)胞癌主要與HBV、HCV病毒感染、黃曲霉素B1（AFB1）暴露、吸煙、飲酒等致病因素有關(guān)[5，6]。近年來(lái)，隨著對(duì)腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)研究的不斷深入，人們已經(jīng)逐漸認(rèn)識(shí)到，腫瘤是一類(lèi)細(xì)胞周期性疾病，細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)紊亂容易導(dǎo)致細(xì)胞的增殖失控，增殖和凋亡的平衡一旦被打破，便可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[7]。國(guó)內(nèi)外均有研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞癌中存在著細(xì)胞周期素A2（cyclinA2）的過(guò)表達(dá)，并與肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系[8，9]。最近國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn) cyclinA2 基因啟動(dòng)子區(qū) rs769236位點(diǎn)G/A多態(tài)性與肝細(xì)胞癌的易感性有關(guān)[10]，到目前為止，尚未見(jiàn)關(guān)于 cyclinA2 基因 rs769236位點(diǎn)G/A多態(tài)性與中國(guó)人群原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性的研究報(bào)道。故本文就重點(diǎn)討論 cyclinA2啟動(dòng)子區(qū) rs769236位點(diǎn)G/A多態(tài)性在中國(guó)漢族人群中分布頻率的差異，分析與原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，并為原發(fā)性肝細(xì)胞癌的早期診斷、治療及判斷預(yù)后提供新的理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料 選擇2012年10月～2017年9月在九江市第一人民醫(yī)院就診確診為原發(fā)性肝細(xì)胞癌的患者180例設(shè)為病例組，診斷符合2001年9月第八屆原發(fā)性肝細(xì)胞癌學(xué)術(shù)會(huì)議上通過(guò)的原發(fā)性細(xì)胞肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)。選擇同期來(lái)我院健康體檢的健康人群180例設(shè)為對(duì)照組。本研究經(jīng)九江市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。所有患者抽血前均未接受過(guò)化療及放療，均未輸過(guò)血，采用統(tǒng)一的流行病學(xué)調(diào)查問(wèn)卷，研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。研究對(duì)象的人口學(xué)信息及相關(guān)危險(xiǎn)因素暴露資料具體標(biāo)準(zhǔn) 吸煙、飲酒史：按WHO標(biāo)準(zhǔn)，一生中連續(xù)或累計(jì)吸煙6個(gè)月或以上者定義為吸煙者，每周飲酒至少一次，連續(xù)6個(gè)月或以上者定義為飲酒者；HBV感染定義：血清感染標(biāo)志物HBsAg陽(yáng)性判定為HBV感染；HCV感染定義：血清HCV-RNA及抗HCV均陽(yáng)性或HCV-RNA單獨(dú)陽(yáng)性即可判定為HBV感染。腫瘤家族史：一級(jí)親屬和（或）二級(jí)親屬患有癌癥者定義為有癌癥家族史，否則就定義為無(wú)。

1.2方法 兩組患者均于清晨采集外周靜脈血2 ml，EDTA-Na抗凝，用于PCR檢測(cè)，采用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)Cyclin A2基因型。

1.2.1 DNA提取 采用DNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)公司），提取每份抗凝外周血的總DNA，操作均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將提取好的DNA溶解于pH8.0 TE中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增 PCR（PCR試劑購(gòu)自TAKARA公司）擴(kuò)增含有rs769236（G/A）位點(diǎn)的片段：上游引物5'-CGCTCACTAGGTGGCTCAG-3'和下游5'-CCGAGGAGGTTGCGAAAGG-3'（南京金斯瑞生物科技有限公司合成）。PCR反應(yīng)在20 μl體系中進(jìn)行， PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，然后95 ℃變性30 sec，60 ℃退火30 sec，72 ℃延伸30 sec，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物凝膠回收 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后切膠回收，操作均按瓊脂糖凝膠回收試劑盒（promega公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.4酶切反應(yīng) 建立20 μl酶切反應(yīng)體系，其中雙蒸水10 μl，緩沖液2 μl，PCR回收產(chǎn)物7 μl，Bgl Ⅰ內(nèi)切酶（Fermentas公司）1 ul，37 ℃恒溫2 h，酶切產(chǎn)物以含溴化乙錠（EB）的1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)成像。PCR擴(kuò)增片段為342bp， GG基因型能被Bgl Ⅰ內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生兩個(gè)片段（259bp、83bp），AA基因型只產(chǎn)生1個(gè)片段（342bp），雜合子GA基因型則產(chǎn)生3個(gè)片段（342bp、259bp和83bp），見(jiàn)圖1。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用？字2檢驗(yàn)比較原發(fā)性肝細(xì)胞癌組和對(duì)照組的人口學(xué)數(shù)據(jù)、基因型以及等位基因頻數(shù)分布。以擬合優(yōu)度？字2檢驗(yàn)計(jì)算 SNP位點(diǎn)各基因型在對(duì)照組中的分布是否符合哈迪一溫伯格遺傳平衡定律（HWE）。以單因素和多因素logistic回歸計(jì)算比值比（ORs）及其95%可信區(qū)限（CI），分析各基因型與肝癌發(fā)生易感性的關(guān)系，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.001表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2結(jié)果

2.1兩組一般情況比較 兩組研究對(duì)象年齡、性別、HCV感染分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；吸煙史、飲酒史、HBV感染比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P<0.001），腫瘤家族史比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 CyclinA2基因多態(tài)性與原發(fā)性肝細(xì)胞癌易感性的關(guān)系 對(duì)照組中cyclinA2 基因rs769236位點(diǎn)（G/A）各基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡（？字2=0.446， P=0.504）。Logistic回歸分析，rs769236 等位基因A（GA+AA）攜帶者患原發(fā)性肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于rs769236GG野生基因型的個(gè)體（校正OR=1.825，95%CI=1.133～2.940），見(jiàn)表2。

3討論

細(xì)胞周期素、細(xì)胞周期素依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）和細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI） 共同調(diào)控著細(xì)胞周期的順利進(jìn)行[10，11]。Wang J等[12]于1990年首次在原發(fā)性肝細(xì)胞癌HBV DNA整合部位上檢測(cè)到CyclinA2基因它定位于人類(lèi)染色體4q27上，由432個(gè)氨基酸組成的，于G1晚期開(kāi)始合成，其含量在S期逐漸增加，并于G2/M期達(dá)到高峰，在M中后期降解。CyclinA2作為細(xì)胞周期的正性調(diào)控因子，在細(xì)胞周期進(jìn)程中起重要作用，可分別與CDK2、CDK1相結(jié)合，以復(fù)合物的形式作用于G1/S期和G2/M期2個(gè)檢查點(diǎn)的轉(zhuǎn)換，而且具有調(diào)節(jié)DNA合成和促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的雙重作用[13-15]。

有研究研究證明，CyclinA2不僅在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中存在高表達(dá)[8，9]，在非小細(xì)胞肺癌[10]、乳腺癌[16]、胃癌[17]、大腸癌[10，18]等多種腫瘤中也存在高表達(dá)，并與這些腫瘤的預(yù)后及早期復(fù)發(fā)的診斷關(guān)系密切。近期研究也表明，抑制CyclinA2的表達(dá)可以有效阻止肝癌細(xì)胞的增殖[19]，從而有效控制腫瘤的進(jìn)一步發(fā)生及發(fā)展[20]。CyclinA2可通過(guò)Akt/FOXO3a/IQGAP/mTOR等信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[21-23]，但具體機(jī)制及其他相關(guān)機(jī)制目前還需進(jìn)一步研究。

單核苷酸多態(tài)（SNP）是人類(lèi)遺傳變異最常見(jiàn)的類(lèi)型，位于啟動(dòng)子區(qū)域的SNP通常對(duì)疾病的發(fā)生和發(fā)展起重要作用[24，25]。本研究提供了CyclinA2 基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性與中國(guó)漢族人群原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)的新信息，本研究發(fā)現(xiàn)rs769236 等位基因A（GA+AA）攜帶者患原發(fā)性肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)高于rs769236GG野生基因型的個(gè)體（校正OR=1.825，95%CI =1.133 -2.940）；通過(guò)進(jìn)一步的分層分析，發(fā)現(xiàn)在無(wú)腫瘤家族史者中攜帶rs769236等位基因A者與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有顯著關(guān)聯(lián)，這說(shuō)明rs769236位點(diǎn)A變異可能是一個(gè)致病因素。我們推測(cè)，當(dāng)CyclinA2基因啟動(dòng)區(qū)的rs769236位點(diǎn)發(fā)生A變異后，使得其基因啟動(dòng)子的活性增加，cyclinA2基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，從而使得其蛋白表達(dá)升高。張益等[19]研究認(rèn)為，CyclinA2蛋白的表達(dá)失控主要是由于其基因的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，也有一部分可能與蛋白質(zhì)翻譯以及翻譯后調(diào)節(jié)失控或蛋白質(zhì)降解減少有關(guān)。當(dāng)CyclinA2過(guò)表達(dá)時(shí)，可在整個(gè)細(xì)胞周期持續(xù)性激活CDK2磷酸化的底物，并直接或間接地釋放過(guò)量的轉(zhuǎn)錄因子（如E2F等），促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)換和DNA合成，如超越了細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制便會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖，并最終癌變。CyclinA2基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)改變了我們對(duì)基因表達(dá)的認(rèn)識(shí)，盡管我們?cè)谶@一領(lǐng)域的認(rèn)識(shí)不斷進(jìn)步但還有大量問(wèn)題需要解決，如CyclinA2基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性是否與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的進(jìn)展、侵襲力、轉(zhuǎn)移情況、預(yù)后等有相關(guān)性，至今國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究中還發(fā)現(xiàn)肝癌組和對(duì)照組比較在年齡、性別、HCV感染分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與既往相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不一致，考慮其原因可能與本實(shí)驗(yàn)入組樣本存在種族差異、地域差異有關(guān)，也可能與本實(shí)驗(yàn)樣本量小存在一定的抽樣誤差有關(guān)，在后續(xù)研究中我們將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量并在不同族群、多個(gè)地域間抽樣，進(jìn)一步探討CyclinA2基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性引發(fā)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的具體分子機(jī)制，并為肝癌的早期診斷、治療及判斷預(yù)后提供新的理論依據(jù)。

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收稿日期：2018-7-17；修回日期：2018-8-15

編輯/肖婷婷