高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)蘋果醋中非法添加物西布曲明及其去甲基衍生物

王百川，傅澤田，張小栓，孔維府，徐榕雪，宮祥博

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙臺(tái)研究院，山東 煙臺(tái) 264000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，北京 100068)

蘋果醋，是指以蘋果汁發(fā)酵而成的蘋果原醋，再兌以蘋果汁等原料而成的飲品。蘋果醋含有維他命、礦物質(zhì)及酵素，其酸性成分能疏通軟化血管、殺滅病菌、增強(qiáng)人體的免疫力和抗病毒能力、改善消化系統(tǒng)等。由于蘋果醋有美容養(yǎng)顏、減肥的功效，所以近幾年來廣受大眾的喜愛。但一些不法商販在蘋果醋中加入西布曲明及其去甲基衍生物等化學(xué)藥品提高其減肥效果。若消費(fèi)者在不知情的情況下，大量飲用含有西布曲明及其衍生物的蘋果醋，會(huì)引起血壓升高、心率加快、厭食、失眠、肝功能異常等嚴(yán)重后果。目前，對(duì)西布曲明及其衍生物的檢測(cè)報(bào)道較少，楊春華等[1]采用甲基化將西布曲明衍生至其代謝物的方法測(cè)定了西布曲明及其代謝物的總量；陳稚等[2]采用HPLC-ESI-MS單級(jí)質(zhì)譜法測(cè)定保健品中N，N-雙去甲基西布曲明。目前，針對(duì)蘋果醋中西布曲明及其去甲基衍生物的檢測(cè)尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)建立了液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜法檢測(cè)蘋果醋中西布曲明及其去甲基衍生物，在國(guó)內(nèi)尚屬首次。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

乙腈：色譜純，F(xiàn)isher Chemical 提供，批號(hào)：75-05-8；甲醇：色譜純，Dikma 提供，批號(hào)：67-56-1； 乙酸：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供，批號(hào)：20140421；乙酸銨：優(yōu)級(jí)純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司提供，批號(hào)：50166。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

西布曲明：中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：100624-200401，純度：99%；N,N-雙去甲基西布曲明：中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：520002-201301，純度：98.5%；

N-單去甲基西布曲明：中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：520001-201301，純度：99%。

1.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC○RBEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；流動(dòng)相：A：乙腈，B：含0.1%乙酸的10 mmol/L乙酸銨；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫Table 1 Gradient elution

1.4 質(zhì)譜條件

DGU20A-API3200 質(zhì)譜儀：質(zhì)譜參數(shù)：ESI正離子模式。離子源參數(shù)見表2。

表2 離子源參數(shù)Table 2 Ion source parameters

掃描模式：多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)。多反應(yīng)檢測(cè)模式見表3。

表3 多反應(yīng)檢測(cè)模式Table 3 MRM mode

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

精密稱取10 mg西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明至10 mL容量瓶中，用60%甲醇溶液定容至刻度，搖勻。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)混合中間溶液的制備

分別吸取0.4 mL的儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中，用60%甲醇溶液定容至刻度，搖勻。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液的配制

精密稱取空白樣品0.3 g于10 mL容量瓶中，精密加入10，20，40，60，80，120 μL標(biāo)準(zhǔn)混合中間溶液，用60%甲醇溶液定容至10 mL，渦旋60 s后超聲提取60 min(功率：700 W)，期間每隔5 min漩渦震蕩30 s，冷卻至室溫后4500 r/min離心10 min。取上清溶液50 μL，加甲醇稀釋至1 mL，渦旋30 s，過0.22 μm有機(jī)濾膜即得西布曲明、N,N-雙去甲基西布曲明和N-單去甲基西布曲明濃度范圍為2，4，8，12，16，24 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 樣品制備

精密稱取空白樣品0.3 g于10 mL容量瓶中，用60%甲醇溶液定容至10 mL，渦旋60 s后超聲提取60 min(功率：700 W)，期間每隔5 min漩渦震蕩30 s，冷卻至室溫，4500 r/min 離心10 min，取2.5 mL溶液用甲醇定容至50 mL，搖勻，上清液過0.22 μm膜，備用。

1.7 檢出限與定量限

精密稱取空白樣品0.3 g于10 mL容量瓶中，加適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用60%甲醇溶液定容至10 mL，渦旋60 s后超聲提取60 min(功率：700 W)，期間每隔5 min漩渦震蕩30 s，冷卻至室溫，4500 r/min離心10 min，取2.5 mL溶液用甲醇定容至50 mL，搖勻。用空白樣品溶液將此溶液稀釋至產(chǎn)生3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)。根據(jù)色譜圖測(cè)得信噪比，按S/N=3∶1，S/N=10∶1，計(jì)算檢出限和定量限。

1.8 方法的準(zhǔn)確性

低濃度加標(biāo)回收溶液：稱取0.3 g空白樣品于10 mL容量瓶中，加入適量標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，按樣品制備方法操作，配制成4 ng/mL的質(zhì)控樣品。

中濃度加標(biāo)回收溶液：稱取0.3 g空白樣品于10 mL容量瓶中，加入適量標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，按樣品制備方法操作，配制成8 ng/mL的質(zhì)控樣品。

高濃度加標(biāo)回收溶液：稱取0.3 g空白樣品于10 mL容量瓶中，加入適量標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，按樣品制備方法操作，配制成16 ng/mL的質(zhì)控樣品。

1.9 精密度

稱取3份0.3 g空白樣品于3個(gè)10 mL容量瓶中，每瓶分別加入標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液10，20，40 μL，按樣品制備方法操作得供試品溶液，供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算試樣中西布曲明、N,N-雙去甲基西布曲明和N-單去甲基西布曲明含量及其RSD值，得精密度結(jié)果。

1.10 重復(fù)性

取濃度為2，4，8 ng/mL的質(zhì)控(QC)樣品各6份，經(jīng)前處理后進(jìn)樣分析，測(cè)得3種非法添加物的峰面積代入隨行的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度及其RSD，得重復(fù)性結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取空白樣品0.3 g于10 mL容量瓶中，精密加入10，20，40，60，80，120 μL標(biāo)準(zhǔn)混合中間溶液，按上述方法進(jìn)行前處理，即得西布曲明、N,N-雙去甲基西布曲明和N-單去甲基西布曲明濃度范圍為2，4，8，12，16，24 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。將10 mL混標(biāo)注入LC-MS/MS中，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并列出標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程和線性范圍。

圖1 西布曲明的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of sibutramine

圖2 N-單去甲基西布曲明的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of N-desmethyl sibutramine

圖3 N,N-雙去甲基西布曲明的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of N,N-di-desmethyl sibutramine

由圖1～圖3可知，西布曲明及其去甲基衍生物在濃度2～24 ng/mL的濃度范圍內(nèi)r值依次為0.9994，0.9998，0.9999，均大于0.99，表明西布曲明及其去甲基衍生物在上述線性范圍良好，選取2～24 ng/mL為本試驗(yàn)的線性范圍。

2.2 專屬性、檢出限和定量限

目標(biāo)化合物出峰處無干擾，一級(jí)質(zhì)譜圖、二級(jí)質(zhì)譜圖應(yīng)清晰可見。

采用空白樣品加標(biāo)的方法測(cè)定[3-7]，精密稱取空白樣品0.3 g于10 mL容量瓶中，按上述方法進(jìn)行前處理，得空白樣品溶液。用空白樣品溶液將混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋至產(chǎn)生3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)。

西布曲明的方法檢出限為15.8 μg/kg，定量限為49.5 μg/kg。N,N-雙去甲基西布曲明的方法檢出限為58.6 μg/kg，定量限為195.4 μg/kg。N-單去甲基西布曲明的方法檢出限為18.0 μg/kg，定量限為61.2 μg/kg。

圖4 西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 MS spectra of sibutramine, N-desmethyl sibutramine,N,N-di-desmethyl sibutramine

圖5 N，N-雙去甲基西布曲明二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.5 MS2 spectra of N,N-di-desmethyl sibutramine

圖6 西布曲明二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.6 MS2 spectra of sibutramine

圖7 N-單去甲基西布曲明二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.7 MS2 spectra of N-desmethyl sibutramine

由圖5～圖7可知，西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明二級(jí)質(zhì)譜圖結(jié)果一致，可能的原因是鄰近N原子的C-C鍵容易發(fā)生α斷裂，N原子所在的基團(tuán)形成中性丟失，這與沈國(guó)芳、朱建所得結(jié)論一致。

2.3 方法的準(zhǔn)確性

采用空白樣品加標(biāo)回收法測(cè)定，取濃度分別為4，8，16 ng/mL的質(zhì)控(QC)樣品3份經(jīng)前處理進(jìn)樣分析，每種濃度平行進(jìn)樣3針，測(cè)得3種非法添加物的峰面積代入隨行的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度，除以理論加入濃度，得方法回收率，即準(zhǔn)確度結(jié)果。

表4 不同濃度下的西布曲明回收率結(jié)果(n=3)Table 4 Recoveries of sibutramine at different concentration levels(n=3)

表5 不同濃度下 N，N-雙去甲基西布曲明回收率結(jié)果(n=3)Table 5 Recoveries of N,N-di-desmethyl sibutramine at different concentration levels(n=3)

表6 不同濃度下N-單去甲基西布曲明回收率結(jié)果(n=3)Table 6 Recoveries of N-desmethyl sibutramine at different concentration levels(n=3)

由表4～表6可知，西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明在高、中、低3個(gè)水平回收率均在80%～110%之間。低濃度回收率略低，隨著濃度的增大，回收率接近100%，這是因?yàn)樵诘退綍r(shí)，系統(tǒng)誤差較大，隨著濃度的增加，系統(tǒng)誤差逐漸變小。

2.4 方法的重復(fù)性

表7 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果(西布曲明) Table 7 Repeatability(RSD)of sibutramine

表8 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果(N-單去甲基西布曲明)Table 8 Repeatability(RSD)of N-desmethyl sibutramine

表9 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果(N,N-雙去甲基西布曲明)Table 9 Repeatability(RSD)of N,N-di-desmethyl sibutramine

取濃度為4 ng/mL的質(zhì)控(QC)樣品各6份經(jīng)前處理后進(jìn)樣分析，測(cè)得3種非法添加物的峰面積代入隨行的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度及其RSD，獲得重復(fù)性結(jié)果。由表7～表9可知重復(fù)性RSD小于5%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 方法的精密度

表10 精密度測(cè)定結(jié)果(西布曲明)Table 10 Precision(RSD)of sibutramine

表11 精密度測(cè)定結(jié)果(N-單去甲基西布曲明)Table 11 Precision(RSD)of N-desmethyl sibutramine

表12 精密度測(cè)定結(jié)果(N,N-雙去甲基西布曲明)Table 12 Precision(RSD)of N,N-di-desmethyl sibutramine

取濃度為4 ng/mL的質(zhì)控(QC)樣品1份連續(xù)測(cè)定6次。測(cè)得3種非法添加物的峰面積代入隨行的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度。由表10～表12可知，西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明精密度均小于3%，表明儀器精密度良好。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)針對(duì)蘋果醋中西布曲明及其去甲基衍生物建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。著重考察了該方法的檢出限、定量限、專屬性、線性范圍、方法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精密度等指標(biāo)。結(jié)果顯示：該方法在2～24 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性；方法檢出限為西布曲明15.8 μg/kg、N,N-雙去甲基西布曲明58.6 μg/kg、N-單去甲基西布曲明18.0 μg/kg；添加濃度在4，8，16 ng/mL 3個(gè)水平條件下的平均回收率在85%～100%之間；3種化合物重復(fù)性小于5%，精密度小于3%。該方法具有操作簡(jiǎn)單、干擾少、靈敏度高、穩(wěn)定性好、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適用于蘋果醋中西布曲明及其去甲基衍生物的測(cè)定。

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