丁勇，張秀妍，王駿，馬琳

(大連市水產技術推廣總站， 遼寧 大連 116023)

孔雀石綠(malachite green，MG)和結晶紫(crystal violet, CV)是人工合成的三苯甲烷類工業(yè)染料，MG廣泛應用于印染、食品加工、醫(yī)藥行業(yè)等各個領域中，CV在細胞學、組織學和細菌學等方面也有廣泛的應用[1-2]。在水產養(yǎng)殖和水產品運輸過程中，MG和CV曾被用于治療水生動物疾病和用作水體消毒劑[3]。MG和CV進入水體后，部分被水生動物吸收，代謝還原成脂溶性的隱色孔雀石綠和隱色結晶紫，因其化學官能團三苯甲烷具有致癌、致畸、致突變等毒副作用[4]，在2002年中國農業(yè)部 193公告中的《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》規(guī)定，禁止在所有動物性食品中使用MG[5]。世界上其他國家也在水產養(yǎng)殖業(yè)中禁止使用CV[6]。但是由于MG和CV的抗菌效果好、價格低廉易得，以及部分養(yǎng)殖用戶對毒副作用長期累積認識不足等原因，目前在水產養(yǎng)殖業(yè)中仍存在違規(guī)使用的情況，部分養(yǎng)殖水體中MG和CV檢出事件偶有發(fā)生[2]，這對養(yǎng)殖的水體環(huán)境、水產品的出口貿易和人們的身體健康等都會產生不良影響[7-8]。

目前，檢測MG、CV及其代謝物殘留量的常用方法有高效液相色譜法、液質聯(lián)用法等。高效液相色譜法通過保留時間定性、外標法定量，前處理過程繁瑣，且與液質聯(lián)用相比，定性準確性稍差。水體中MG和CV的殘留通常很低，因此需要靈敏度高、定性可靠、定量準確的方法[9-11]。有研究人員對養(yǎng)殖水體中MG和CV及其代謝物的檢測方法做了研究[12-13]，但鑒于其代謝物隱色孔雀石綠和隱色結晶紫均為脂溶性化合物，在水中溶解度很小，含量極低[14]，因而需要更多的相關研究。本實驗建立了應用液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定養(yǎng)殖水體中MG和CV含量的方法，有效校正了前處理過程中的誤差和損失，并采用內標法提高回收率，方法穩(wěn)定、可靠，可為檢測養(yǎng)殖水體中MG和CV含量提供方法支持。

1 實驗方法

1.1 樣品采集及準備

實驗中用到的水樣分別采自遼寧省莊河劉家水產養(yǎng)殖場、金州新豐水產育苗場和頂廚飯店暫養(yǎng)池，采樣時，用少量水樣清洗500 mL棕色玻璃細口瓶兩次，再慢慢將瓶充滿，蓋緊瓶塞。水樣到達實驗室后先經0.45 μm濾膜過濾，除去水中的固體雜質，備用。

1.2 儀器設備

本實驗使用的主要儀器包括：I-Class超高效液相色譜(美國Waters公司)；TQ-S三重四級桿串聯(lián)質譜儀(美國Waters公司，配有電噴霧ESI源)；超純水儀(美國Millipore公司)；分液漏斗振蕩器；旋轉蒸發(fā)儀；渦旋振蕩器；固相萃取裝置；電子天平等。

1.3 藥品與試劑

本實驗使用的主要藥品包括：孔雀石綠標準品(純度大于94%，德國Dr. Ehrenstorfer公司);結晶紫標準品(純度>95%、Sigma公司)；氘代孔雀石綠(MG-D5)、氘代結晶紫(CV-D6)標準品(純度>95%， VITEG公司)；中性氧化鋁小柱(Waters，3 g/6 mL)，使用前用5 mL乙腈活化；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)；二氯甲烷(色譜純，Tedia)；乙酸胺(優(yōu)級純，天津科密歐公司)；5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液；甲酸(優(yōu)級純，Thermo試劑)等。

1.4 配制標準溶液

準確稱取MG、CV、氘代孔雀石綠和氘代結晶紫各10.0 mg，用乙腈分別配制成100 μg/mL標準儲備溶液，-18 ℃避光保存。用乙腈逐級稀釋成MG和CV的混合標準使用液、氘代孔雀石綠和氘代結晶紫的混合標準使用液，終濃度均為100 ng/mL。用乙腈-乙酸銨溶液(1∶1,V/V)稀釋前述混合標準使用液配制成適當濃度的混合標準上機溶液，每毫升該混合標準上機溶液中含有氘代孔雀石綠和氘代結晶紫各2.0 ng[15]。

1.5 樣品前處理

移取水樣 100.0 mL，置于 250 mL 分液漏斗中。向分液漏斗中加入質量濃度為100 ng/mL的氘代孔雀石綠和氘代結晶紫混合標準工作溶液20.0 μL，振搖混勻。加入 10.0 mL 乙腈、 35.0 mL 二氯甲烷， 劇烈振搖7 min，靜置20 min，將下層溶液轉移至150 mL梨形瓶中；繼續(xù)向分液漏斗中加入 10.0 mL 乙腈、35.0 mL 二氯甲烷，劇烈振搖7 min，靜置20 min，合并下層溶液于上述150 mL梨形瓶中，于(42±2) ℃水浴中減壓濃縮至近干。用5 mL乙腈溶解殘留物，振蕩混勻。將梨形瓶中的溶液轉移到活化過的中性氧化鋁小柱上，用4 mL乙腈淋洗，收集全部流出液，于(42±2) ℃的水浴中旋轉蒸發(fā)至近干，向梨形瓶中加入1.0 mL 乙腈-乙酸銨緩沖溶液(1∶1,V∶V)，渦旋振蕩充分溶解后，經 0.22 μm針孔式濾膜過濾后上機檢測。

1.6 儀器條件

色譜條件：Waters BEH C18反相色譜柱(2.1 mm×100 mm，粒度 1.7 μm)；柱溫為35 ℃；進樣量為1 μL；流動相為乙腈-0.1 % 甲酸水溶液(1∶1，V/V)；流速為0.3 mL/min。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描模式；去溶劑氣溫度為500 ℃；霧化氣、干燥氣為高純氮氣，氣體流量為900 L/hr；碰撞氣為氬氣，輸出壓力為0.06 MPa；離子模式為多反應監(jiān)測掃描模式；選擇反應監(jiān)測母離子、子離子、碰撞能量和錐孔電壓質譜參數(shù)見表1。

表1 氘代孔雀石綠、孔雀石綠、氘代結晶紫、結晶紫的質譜條件Tab.1 Mass spectrometry parameters for MG-D5 、MG 、CV- D6 and CV

注：帶*的為定量離子。

2 結果與討論

2.1 萃取方案的優(yōu)化

根據文獻[16]，本實驗選用乙腈和二氯甲烷作為水樣中MG和CV的提取溶劑。乙腈作為輔助萃取溶劑，用量為10 mL，可以提高二氯甲烷對MG和CV的提取效率[17]。

采用正交試驗，對影響加標回收率的3個因素(萃取時間、萃取次數(shù)和萃取試劑用量)進行三因素三水平的實驗[18]，確定萃取方案。按照表2 的正交試驗來確定這些因素和水平對加標回收率的影響，選取最優(yōu)化的萃取方案，加標量均為5.0 ng/L，每個方案平行3次，求出回收率平均值，結果見表3 。

表2 正交實驗因素水平表Tab.2 Table of factor and level of orthogonal experiment

注：A為二氯甲烷用量；B為萃取時間；C為萃取次數(shù)，下同。

表3 不同萃取方案的回收率Tab.3 Recoveries of different extraction programmes n=3

根據表3所得的MG回收率和CV回收率，計算K值和極差R，Ki表示任意列上水平號為i時所對應的試驗結果之和,極差R=Kmax-Kmin,結果如圖1、圖2和圖3。

本實驗通過對二氯甲烷用量、萃取時間和萃取次數(shù)進行正交試驗，確定了優(yōu)化的萃取方案。由圖1、圖2和圖3可知，不同因素影響回收率的程度為：二氯甲烷用量>萃取時間>萃取次數(shù)，這對MG和CV回收率的影響是一致的，最佳組合方案為： A3B2C2 ，對應的實驗條件分別為二氯甲烷用量35 mL、萃取時間5 min、萃取次數(shù)2次。在此條件下，三次平行實驗MG的平均回收率為97.8%，CV的平均回收率為95.6%。另外液液萃取操作時，靜置分層10 min，使有機相和水相分層明顯，便于收集乙腈-二氯甲烷混合物。

圖1 孔雀石綠正交實驗的K值A為二氯甲烷用量；B為萃取時間；C為萃取次數(shù)，下同。Fig.1 K value of MG orthogonal experimentA represents amount of dichloromethane; B represents time of extraction; C represents extraction times. The same below.

2.2 固相萃取小柱的確定

養(yǎng)殖水體中色素、藻類和浮游生物等含量較高，采用適當?shù)墓滔噍腿⌒≈梢匀コs質凈化上機液，保護色譜和質譜系統(tǒng)，減少基質效應對檢測的影響。在研究水中MG和CV的檢測方法時，參考文獻[9,12,19]，對PRS小柱、MCX小柱(混合型陽離子交換柱) 和中性氧化鋁小柱的凈化效果進行了比較，這3種常用的固相萃取小柱對MG和CV的回收率均在70%以上，基質效應對檢測影響均較小。與水產品和沉積物等基質相比較，養(yǎng)殖水體雜質較少，使用性價比較高、適用性較廣的中性氧化鋁小柱即滿足檢測要求，因而本研究采用中性氧化鋁小柱作為萃取液的凈化小柱。

2.3 標準曲線的繪制

MG和CV的混合標準上機溶液中，質量濃度梯度依次為0.2、 0.4、 1.0、 2.0、 10.0、和20.0 ng/mL，其中同位素內標的含量均為2.0 ng/mL。按照1.6節(jié)的儀器條件上機檢測，數(shù)據處理選用內標法，MG的標準曲線方程為y=0.916x-0.224,線性相關系數(shù)R為0.998；CV的標準曲線方程為y=0.964x+0.033 3，線性相關系數(shù)R為0.998(y為外標和內標峰面積的比值，x為外標和內標濃度的比值)。結果表明：MG和CV在0.2～20.0 ng/mL范圍內線性關系良好。

2.4 方法的定量限

采用空白樣品添加低濃度的標準溶液，按1.5、1.6節(jié)進行測定，以信噪比S/N≥10[20]確定MG和CV的定量限(LOQ)均為2.0 ng/L，滿足MG和CV低濃度殘留量的檢測要求。

2.5 準確度和精密度

本方法的準確度通過測定加標樣品的平均回收率來確定，精密度通過計算平均回收率的相對標準偏差來確定。加標樣品的添加水平分別為2、4、10、20 ng/L，每個添加水平做6個平行樣品，分3批次進行準確度和精密度實驗[21]，測定結果見表4。在取樣量為100 mL、MG和CV的添加水平為2.0～20.0 ng/L時，平均回收率為89.9%～102.0%，相對標準偏差小于10%，說明該方法具有較高的準確度和較好的精密度，滿足水中MG和CV殘留的檢測要求。質量濃度為0.2 ng/mL的MG和CV標準上機溶液的質譜總離子流圖見圖4。

圖3 孔雀石綠和結晶紫正交實驗的R值Fig.3 R value of MG and CV orthogonal experiment

圖4 孔雀石綠和結晶紫的總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of MG and CV

n=6

3 結論

本研究建立了通過液相色譜-串聯(lián)質譜同時檢測養(yǎng)殖水體中MG和CV殘留的方法。該方法對水中MG和CV的含量可以準確定量，定量限均為2.0 ng/L，線性范圍為0.2～20.0 ng/mL，批內和批間相對標準偏差均小于10%，重復性較好，滿足養(yǎng)殖水體中MG和CV的檢測要求。

[1] 馬瑞欣，孫偉彬， 郎玉苗,等. 養(yǎng)殖用水中孔雀石綠和結晶紫及其代謝物的測定[J].河北漁業(yè)，2010,38(6)：21-25.

[2] 李康柏，陳潤發(fā)，洪瑞申,等.HPLC-MS/MS同位素內標法測定水體中孔雀石綠、結晶紫及其代謝物[J]. 食品安全導刊， 2015, 9(4)：75-78.

[3] 王麗玲，馮翠霞，胡爾萍,等.珠海市餐廳池養(yǎng)水產品及池水中孔雀石綠殘留量的調查[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2007, 17(9)：1687-1689.

[4] 趙麗娜，侯玉澤，張改平, 等. 孔雀石綠的毒性及其殘留檢測研究進展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)(科技版)， 2011, 54(2)：76-78.

[5] 中華人民共和國農業(yè)部. 中華人民共和國農業(yè)部公告 第193號《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》[EB/OL].(2011-04-22) [2017-04-15]. http://jiuban.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/201104/t20110422_1976324.htm.

[6] 洪波，袁希平，萬譯文, 等. 水中孔雀石綠、結晶紫殘留量的同時測定[J].食品與機械，2012, 28(4):84-86.

[7] 張彤晴，楊洪生，林海, 等. 高效液相色譜法測定養(yǎng)殖水體孔雀石綠和無色孔雀石綠[J].水產學報，2007, 31(5)：699-703.

[8] 崔力拓，李志偉. 海水養(yǎng)殖自身污染的現(xiàn)狀與對策[J]. 河北漁業(yè)， 2006，34(10):4-5.

[9] 孫滿義，楊賢慶，李來好, 等. 養(yǎng)殖水體中孔雀石綠高效液相熒光檢測法的研究[J]. 食品科學, 2008, 29(8)：513-516.

[10] 桂英愛，馬琳，王丹, 等. 水中孔雀石綠的高效液相色譜測定法[J]. 環(huán)境與健康雜志，2007, 24(8)：633-634.

[11] 劉桂華，劉紅河. 高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定水中孔雀石綠和隱色孔雀石綠[J]. 衛(wèi)生研究， 2007, 36(6)：732-733.

[12] 王旭峰，王強，趙東豪,等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定養(yǎng)殖水和沉積物中孔雀石綠、結晶紫及其代謝物殘留[J]. 分析試驗室， 2015, 34(6)：702-706.

[13] 馮敏鈴，李盛安，王麗娜,等. 水產養(yǎng)殖水中孔雀石綠和結晶紫及其代謝物的殘留測定[J]. 廣東化工，2016, 43(15)：242-243.

[14] 趙東豪，黎志廣，林欽, 等. 高效液相色譜串聯(lián)質譜測定沉積物中的孔雀石綠、結晶紫及其隱色代謝物[J]. 廣東農業(yè)科學, 2011， 47(2)：171-173.

[15] 中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會. GB/T 19857—2005 水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法[S]. 北京：中國標準出版社，2005.

[16] 劉少彬，王耀，鄒濰力, 等. 水產品中孔雀石綠測定方法的改進[J]. 現(xiàn)代食品科技， 2010, 26(3):314-315.

[17] 張秀妍，李勃，丁勇, 等. 液相色譜-串聯(lián)質譜法測定養(yǎng)殖水體中的孔雀石綠[J].中國漁業(yè)質量與標準，2015, 5(3)：34-39.

[18] 馬美湖，婁愛華，葛長榮,等.冷卻肉生產中保鮮技術的研究——溶菌酶、Nisin、山梨酸鉀保鮮正交試驗[J]. 食品科學， 2005, 26(3)：235-243.

[19] 趙東豪，王強，王旭峰，等. 超高效液相色譜串聯(lián)質譜法測定水產養(yǎng)殖水體中49種獸藥的殘留量[J]. 中國漁業(yè)質量與標準，2017, 7(3)：30-37.

[20] 胡瑩瑩，葉賽，李愛，等. 高效液相色譜法分析海水中的氯霉素[J]. 環(huán)境化學， 2005， 24(4):481-482.

[21] 中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會. GB/T 27404—2008 實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測[S]. 北京：中國標準出版社，2008.