儲黃偉，程 燦，牛付安，周繼華，涂榮劍，羅忠永，王新其，曹黎明

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所，上海201403）

水稻是我國最主要的糧食作物，有超過65%的人口以水稻為主糧。由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是水稻的主要病害之一。稻瘟病的爆發(fā)，會嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量，甚至導(dǎo)致部分病害嚴(yán)重區(qū)域絕收［1］。在所有的稻瘟病防治措施中，稻瘟病抗病品系的培育和種植被認(rèn)為是最有效、經(jīng)濟和安全的控制該病害的措施［2-3］。

傳統(tǒng)的稻瘟病抗性育種，依賴于雜交和表型的選擇，存在育種周期長，工作量大，準(zhǔn)確率低等問題。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用和已知稻瘟病抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進行分子標(biāo)記輔助育種，逐漸成為稻瘟病抗性育種的主要手段。目前，至少已報道了70個稻瘟病抗性位點共85個主效基因［4］。在這些稻瘟病主效抗性基因中，已經(jīng)有 Pb1、Pia、Pib、Pid2、Pid3、Pik、Pik-h/Pi54、Pik-m、Pik-p、Pish、Pit、Pita、Piz-t、Pi1、Pi2、Pi5、Pi9、pi21、Pi25、Pi36、Pi37、Pi56、Pi63和 PiCO39等 24個基因被成功地克?。▏宜緮?shù)據(jù)中心，稻瘟病主效抗性基因列表http：//www.ricedata.cn/gene/gene＿pi.htm）。根據(jù)已經(jīng)克隆的稻瘟病抗性基因與其感病等位基因之間的序列差異而設(shè)計的功能性標(biāo)記，可以不用費時費力地接菌鑒定，而準(zhǔn)確和快速地檢測到水稻品系抗稻瘟病基因的存在［5］，這為鑒定攜帶稻瘟病抗性基因的種質(zhì)資源以及開展抗稻瘟病的聚合育種帶來了新的契機。

在上海地區(qū)，每年的水稻種植面積大約在10萬hm2左右，在這其中雜交粳稻的面積大約占1/3左右。然而，對于目前在上海地區(qū)使用的雜交粳稻骨干親本中稻瘟病抗性基因的基因型，還沒有進行鑒定。本研究利用 Pi2［6-8］、Pi5［6，9］、Pi9［6，10］、Pi54［11-13］、Pia［14-15］、Pib［16-18］、Pit［5］、Pita［6，19］等 8個稻瘟病抗性基因的功能性標(biāo)記，分析這8個抗稻瘟病基因在36份恢復(fù)系和42份不育系中的分布，以期為配制攜帶有不同稻瘟病抗性基因的雜交水稻組合，以及利用標(biāo)記輔助選擇聚合多個稻瘟病抗性基因品系的培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 水稻品系

供試的36份恢復(fù)系和42份不育系材料（表1）均來自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所水稻雜種優(yōu)勢利用課題組，是課題組選育雜交粳稻的骨干親本。

表1 水稻品系中稻瘟病抗性基因的基因型檢測Table 1 Genotypic detection of blast-resistant genes in rice lines

1.2 水稻DNA提取

每個水稻品系取50 mg左右葉片，用剪刀剪碎，放入2 mL離心管，加入600μL 1.5×CTAB溶液（1.5%CTAB，75 mmol/L Tris-HCl，15 mmol/L EDTA，1.05 mol/L NaCl，pH 8.0）和1粒直徑5 mm的鋼珠，在快速研磨儀上70 Hz的頻率震蕩研磨90 s；研磨后的樣品在56℃水浴鍋中溫浴20 min，加入450μL氯仿，劇烈震蕩后，12 000 r/min離心10 min；取450μL上清液到另一個1.5 mL的離心管中，加入900μL的無水乙醇，混勻后在－20℃冰箱放置10 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清，晾干后加入200μL的雙蒸水溶解DNA，置于－20℃冰箱備用。

1.3 稻瘟病抗性基因的檢測

本研究檢測 Pi2［6-7］、Pi5［6，9］、Pi9［6，10］、Pi54［11-13］、Pia［14-15］、Pib［16-18］、Pit［5］、Pita［6，19］等 8個稻瘟病抗性基因，其功能性分子標(biāo)記的引物信息見表2。PCR擴增以及產(chǎn)物檢測的方法參照表2中相應(yīng)的文獻。

表2 PCR擴增所用的引物Table 2 Primers used for PCR amplification

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

根據(jù)PCR產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果，檢出稻瘟病抗性等位基因記為1，檢出感病等位基因記為0。然后利用NTsys 2.1e軟件中的SHAN子集的UPGMA方法進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病抗性基因的檢測

檢測了36個恢復(fù)系和42個不育系中Pi2、Pi5、Pi9、Pi54、Pia、Pib、Pit和Pita等8個稻瘟病抗性基因的基因型（表1）。結(jié)果表明：Pib稻瘟病抗性基因在本研究檢測的水稻品系中分布最為廣泛，在54個（28個不育系和26個恢復(fù)系）品系中檢測到了抗性基因的存在；其次從高到低依次為Pia、Pia54、Pi9、Pi2和Pita，分別在45個（15個不育系和30個恢復(fù)系）、33個（11個不育系和22個恢復(fù)系）、24個（12個不育系和12個恢復(fù)系）、23個（15個不育系和8個恢復(fù)系）和20個（18個不育系和2個恢復(fù)系）品系中檢測到；而Pi5和Pit是在本研究檢測的水稻品系中出現(xiàn)頻率最低的稻瘟病抗性基因，分別只在5個品系中檢測到，其中Pi5抗性基因在1個不育系和4個恢復(fù)系中，而含有Pit抗性基因的5個品系都是不育系（圖1）。

圖1 稻瘟病抗性等位基因在檢測水稻品系中的分布頻率Fig.1 Frequency distribution of blast-resistant genes in rice lines

在所有檢測的78個水稻品系中，在8527A、徐1A和016A等3個品系中未檢測到稻瘟病抗性基因的存在，而含有稻瘟病抗性基因最多品系申11A含有6個抗性基因，其余含有1—5個抗性基因的分別有10個、25個、18個、19個和2個水稻品系（圖2）。

圖2 稻瘟病抗性等位基因數(shù)目在檢測水稻品系中的分布頻率Fig.2 Frequency distribution of blast-resistant gene numbers in rice lines

2.2 遺傳差異聚類分析

根據(jù)8個稻瘟病抗性基因的基因型特征，對78個水稻品系進行聚類分析。結(jié)果表明：檢測的水稻品系間遺傳相似系數(shù)的變化范圍為0.55—1，在相關(guān)系數(shù)大于0.67的水平上，可以將78個水稻品系分為5組，其中組Ⅰ包含31個品系，組Ⅱ包含4個品系，組Ⅲ包含20個品系，組Ⅳ包含13個品系，組Ⅴ包含10個品系（圖3）。

圖3 78個水稻品系遺傳差異聚類分析Fig.3 Genetic distance-based cluster analysis of 78 rice lines

3 討論

在目前已經(jīng)報道的85個稻瘟病抗性主效基因中，除了Pi21［20］和 Pi55［21］兩個是隱性基因，其他的稻瘟病抗性等位基因都是顯性的（國家水稻數(shù)據(jù)中心，稻瘟病主效抗性基因列表http：//www.ricedata.cn/gene/gene＿pi.htm）。解釋雜種優(yōu)勢形成機理的“顯性假說”認(rèn)為在等位基因中多數(shù)顯性基因是有利的，相對的隱性基因是不利的。在雜交后代中來自一個親本的顯性等位基因可以掩蓋來自另一個親本的隱性等位基因，使得在雜交后代中具有比單個親本更多的有利顯性基因，從而使雜合后代表現(xiàn)出更好的生長、抗逆和抗病等等性狀［22-23］。根據(jù)本研究稻瘟病抗性基因的鑒定和遺傳差異的聚類分析結(jié)果，在配制雜交組合親本選擇的過程中，可以按照稻瘟病抗性基因的互補及遠緣雜交優(yōu)勢的原則進行。根據(jù)這一原則，用不育系申9A分別與恢復(fù)系申繁24號和申繁26號配制了2個雜交組合申優(yōu)415和申優(yōu)26。在遺傳差異的聚類分析結(jié)果中，申9A、申繁24號和申繁26號分別屬于組Ⅴ、組Ⅰ和組Ⅲ，申9A含有P i2、Pib和Pita等3個抗性基因，申繁24號含有Pi9、Pi54、Pia和Pib等4個抗性基因，而申繁26號含有Pi9、Pi54和Pia等3個抗性基因，這樣就使得雜交組合申優(yōu)415和申優(yōu)26都含有了Pi2、Pi9、Pi54、Pia、Pib和Pita等6個稻瘟病抗性基因。在這6個基因中，Pi2和Pi9是同一個基因位點上的復(fù)等位基因［24］。Pi2對稻瘟病的抗譜相當(dāng)廣，將攜帶Pi2的親本C101A51接種從華東、華南和西南12個省區(qū)收集來的792個稻瘟病小種，對其中92.45%的小種表現(xiàn)出抗性［25］，此外Pi2還對來自13個國家的43個稻瘟病菌株中的36個表現(xiàn)抗性［24］；Pi9的抗性同樣很廣，對來自13個國家的43個稻瘟病菌株均表現(xiàn)出很高的抗性［24］；Pia抗性基因的抗譜較窄，對來自于中國10個省區(qū)的稻瘟病群體接種鑒定，僅對來自江蘇的稻瘟病群體表現(xiàn)出較強的抗［15］；Pib基因?qū)碜匀毡镜拇蠖鄶?shù)稻瘟病小種以及中國的菌株ZB13和ZC15表現(xiàn)出較好的抗性［16］；Pi54是一個廣譜的稻瘟病抗性基因，對來自印度的大多數(shù)稻瘟病小種表現(xiàn)出抗性［13］；Pita對稻瘟病菌菌株ZN57（IC-17）和ZN61（IB-49）表現(xiàn)出較好的抗性［26］。通過親本的選擇，使最終用于生產(chǎn)的雜交組合申優(yōu)415和申優(yōu)26中都含有了6個稻瘟病抗性主效基因，保證了這2個組合具有了比較廣譜的稻瘟病抗性，這2個組合在上海及周邊地區(qū)生產(chǎn)試驗中表現(xiàn)出較強的稻瘟病抗性。

本研究檢測的8個稻瘟病抗性基因中，Pi5和Pit這2個基因的分布較少，Pi5在4個恢復(fù)系和1個不育系中存在，而Pit只在5個不育系中檢測到。對于這類基因，可以應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇的手段轉(zhuǎn)入到更多的水稻品系中。

檢測結(jié)果還發(fā)現(xiàn)8527A、徐1A和016A等3個不育系中不含本研究中檢測的8個稻瘟病抗性基因中的任何一個，另外還有10個品系中只檢測到了一個稻瘟病抗性基因。在應(yīng)用這類水稻品系配制雜交組合時，應(yīng)盡量選擇與含有多個稻瘟病抗性基因的品系進行配組。然而在雜交水稻制種的過程中，選用這類稻瘟病抗性較差的品系作為親本，存在著一定的風(fēng)險，今后將考慮應(yīng)用標(biāo)記輔助選擇的手段，將稻瘟病抗性基因引入這些品系。

目前已知的稻瘟病主效抗性基因已經(jīng)有85個，已經(jīng)克隆的也有24個，而本研究中只檢測了8個稻瘟病抗性基因。在今后的工作實踐中，有必要去檢測更多的稻瘟病抗性基因在本課題組核心種質(zhì)資源中的分布，為雜交組合的配制及分子標(biāo)記輔助選擇育種提供理論基礎(chǔ)。

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