QX200微滴式數(shù)字PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2

吳 瀟，呂貝貝*，蔣 瑋，王金斌，4，白 藍，武國干，胡為一，唐雪明**

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海201106；2農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（上海），上海201106；3上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海201106；4上海瑞豐農(nóng)業(yè)科技有限公司，上海201106；5上海安景科技有限公司，上海200051）

微滴式數(shù)字PCR（Droplet digital PCR，ddPCR）是近年來迅速發(fā)展起來的一種突破性地檢測和定量核酸的技術(shù)，其基本原理是通過將模板極度稀釋，將所有樣品在相同條件下進行PCR擴增，實現(xiàn)理論上的單分子擴增，有PCR擴增熒光信號記為1，無熒光信號記為0，反應(yīng)結(jié)果采用泊松概率分布公式，便可計算出樣本的原始濃度［1-5］。

外源基因的檢測是轉(zhuǎn)基因生物安全評價的重要評價指標之一［6］。目前，外源基因拷貝數(shù)和含量分析多采用實時熒光定量PCR技術(shù)（Real-time Quantitative PCR，qPCR）。qPCR技術(shù)在分析外源基因拷貝數(shù)時必須依賴于已知拷貝數(shù)的內(nèi)參基因和標準曲線的建立，是一種相對定量方法，且標準曲線的建立易受到模板純度、引物和探針的濃度等諸多因素影響［7］。與qPCR方法相比，微滴式數(shù)字PCR技術(shù)不依賴于標準曲線，實現(xiàn)了DNA檢測從相對定量到絕對定量的飛躍［8-14］。QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)（QX200TMDroplet DigitalTMPCR）獲得了歐盟體外診斷（in vitro diagnostic，IVD）產(chǎn)品 CE認證（CE IVD marking），這是該領(lǐng)域首個獲得CE認證的數(shù)字PCR系統(tǒng)。QX200 ddPCR系統(tǒng)可以直接從分析器同時讀取外源基因和內(nèi)標基因的拷貝數(shù)，快速計算出外源基因的百分含量，測定過程更為方便和快捷。

目前，尚無QX200 ddPCR技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因生物外源基因檢測分析的相關(guān)報道。本試驗研究轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2的微滴式數(shù)字QX200 PCR檢測方法，以期為轉(zhuǎn)基因生物中外源基因拷貝數(shù)和外源基因含量的精確測定提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2陽性品（100%）和轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2標準品（轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2含量為10%）購于European Reference Materials公司，Quant-iTTMPicoGreen?dsDNA Kit購于美國Invitrogen公司，ddPCR Master Mix、Droplet Generation Oil、Droplet Reader Oil購于美國 Bio-Rad公司，DNeasy Plant Mini Kit購于天根生化科技有限公司。

1.2 儀器

Nanodrop ND-1000核酸蛋白定量儀（Thermo Scientific，美國），QX200TMDroplet DigitalTMPCR系統(tǒng)（Bio-Rad，美國，包括微滴生成儀和微滴分析儀），ABI StepOne Plus定量 PCR儀（Applied Biosystem，美國）。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取和純化

轉(zhuǎn)基因大豆標準品使用DNeasy Plant Mini Kit純化，具體步驟見試劑盒說明書。提取的基因組DNA使用Nanodrop ND-1000核酸蛋白定量儀測定純度和濃度（步驟略）。

1.3.2 引物和探針

涉及的PCR擴增引物和探針序列參照GB/T 19495.5—2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸定量PCR檢測方法》，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體序列見表1。

表1 引物和探針序列Table 1 Sequences of primers and probes

1.3.3 qPCR反應(yīng)體系和條件

轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2陽性品提取的DNA含量為1.762×105copies/μL，按照10倍梯度稀釋為：1.762×104copies/μL、1.762×103copies/μL、1.762×102copies/μL、1.762×101copies/μL，用于構(gòu)建實時熒光定量PCR標準曲線。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參見GB/T 19495.5—2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸定量PCR檢測方法》。每個模板重復(fù)3個平行擴增。

1.3.4 ddPCR反應(yīng)體系和條件

ddPCR反應(yīng)分為4個步驟：PCR體系配制、微滴生成、PCR擴增和微滴分析。ddPCR擴增體系為20μL，包含10μL 2×ddPCR Master Mix，10μmol/L正向引物和反向引物各1.8μL（2對）、探針0.5μL（2條），DNA模板1μL，H2O 0.8μL。將20μL PCR Mix和70μL微滴生成油加入微滴生成卡中生成微滴，將生成的微滴混合液加入96孔板中，用錫箔紙密封后置入ABI-PCR儀中運行。PCR擴增程序：95℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，59℃退火1 min，40個循環(huán)；98℃固化10 min。每個模板重復(fù)3個平行檢測。擴增結(jié)束后，將96孔板置入微滴讀取儀中讀取信號，有熒光信號的微滴為陽性，無熒光信號的為陰性，軟件統(tǒng)計每個樣品里陽性和陰性微滴數(shù)，并使用軟件QuantaSoft Version 1.7分析數(shù)據(jù)。

1.3.5 實時熒光定量PCR計算轉(zhuǎn)基因成分的含量

內(nèi)標基因拷貝數(shù)已知，因此首先根據(jù)內(nèi)標基因的熒光數(shù)據(jù)構(gòu)建標準曲線，按照公式：轉(zhuǎn)基因成分的含量＝外源基因拷貝數(shù)/內(nèi)標基因拷貝數(shù)，計算出轉(zhuǎn)基因成分的含量［15］。用10%的標準品作為待測樣品進行測定。

1.3.6 ddPCR計算外源基因拷貝數(shù)和含量

ddPCR采用直接計數(shù)的方法進行拷貝數(shù)分析。PCR擴增結(jié)束后，認為有熒光信號反應(yīng)單元中至少包含1個拷貝的目標分子，整體符合泊松分布［2，16-17］。根據(jù)數(shù)字PCR反應(yīng)總微滴數(shù)和有熒光信號的微滴數(shù)以及樣品的稀釋倍數(shù)，就可以得到樣本最初的濃度和拷貝數(shù)。用10%的標準品作為待測樣品進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 qPCR拷貝數(shù)分析結(jié)果

根據(jù)不同濃度模板測得的熒光值構(gòu)建標準曲線，如圖1所示。內(nèi)標基因標準曲線的回歸方程為：C t＝－3.2318x+36.631，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999。外源基因標準曲線的回歸方程為：C t＝－3.3251x+37.082，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.998。把待測標準品測得的C t值代入兩個標準曲線中，再通過1.3.5的公式計算出轉(zhuǎn)基因大豆的含量為10%，與標準品實際轉(zhuǎn)基因成分的含量一致。

圖1 內(nèi)標基因和結(jié)構(gòu)特異性基因的標準曲線Fig.1 Standard curves of the endogenous reference gene and structure-specific gene

2.2 ddPCR分析

2.2.1 ddPCR信號識別

有效的微滴生成數(shù)目是ddPCR的關(guān)鍵，只有生成的微滴數(shù)大于8 000時，目標分子的分布才能適用于泊松分布的統(tǒng)計學(xué)原理，才能準確計算出目標分子的拷貝數(shù)［18-20］。ddPCR通過擴增形成的陽性微滴和陰性微滴如圖2和表2所示。由表2可見，反應(yīng)中形成的微滴數(shù)為10 863—13 859，均大于10 000，滿足ddPCR微滴的分析要求。由圖2可見，陰性微滴和陽性微滴明顯分為兩個區(qū)域，ddPCR系統(tǒng)可準確檢測出陽性微滴和陰性微滴的數(shù)目。根據(jù)每個反應(yīng)生成的微滴數(shù)來看，本研究建立的ddPCR體系微滴生成穩(wěn)定，具有良好的重復(fù)性，能夠用于轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2外源基因拷貝數(shù)的分析。

2.2.2 轉(zhuǎn)基因含量分析

根據(jù)軟件讀取的外源基因和內(nèi)標基因的微滴數(shù)，便可計算出外源基因和內(nèi)標基因的濃度，通過1.3.5的公式，計算出外源基因的拷貝數(shù)，分析最低檢測限；同時可計算出待測樣品轉(zhuǎn)基因成分的含量（表2）。

圖2 微滴式數(shù)字PCR測定結(jié)構(gòu)特異性基因Fig.2 Detection of structure-specific gene by ddPCR

圖3 微滴式數(shù)字PCR測定Lectin基因Fig.3 Detection of Lectin gene by ddPCR

從表2可見，生成的微滴數(shù)最少為10 863，最多為13 859，完全滿足ddPCR數(shù)據(jù)分析的需要，并且可計算出ddPCR方法的最低檢出限約為2個拷貝/（20μL）。在4個稀釋梯度下，均能測出轉(zhuǎn)基因成分的含量，前3個稀釋梯度的轉(zhuǎn)基因成分的含量非常接近10%，最后一個稀釋梯度由于模板含量太低，轉(zhuǎn)基因成分含量的計算值出現(xiàn)一定的偏差。如果外源基因和內(nèi)標基因的拷貝數(shù)關(guān)系為1∶1，那么可以從微滴讀取器的界面通過微滴數(shù)直接算出轉(zhuǎn)基因成分的含量。如本研究中，測定外源結(jié)構(gòu)特異性基因的微滴數(shù)為78，測定內(nèi)標基因Lectin的微滴數(shù)為774，待測樣品的含量為78/774＝10.07%.

表2 ddPCR基因拷貝數(shù)分析結(jié)果Table 2 Genetic copy number analysis by ddPCR

3 討論

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用，如何精準測定轉(zhuǎn)基因植物、動物的外源基因拷貝數(shù)以及計算轉(zhuǎn)基因成分的含量，已經(jīng)成為現(xiàn)今轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)研究的一個關(guān)鍵點［19-20］。傳統(tǒng)的Southern Blot方法分析基因拷貝數(shù)所需的周期長、工作量大、準確性較差。qPCR是目前最常用的轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)［21］，使用qPCR進行外源基因的拷貝數(shù)分析必須依賴標準品或者構(gòu)建標準質(zhì)粒分子，PCR體系也需要摸索和優(yōu)化，對未知品濃度的計算依賴于標準曲線的構(gòu)建，因此是一種相對定量的分析方法，結(jié)果并非十分精確［20］。

本研究同時使用qPCR和ddPCR對10%的標準品進行了轉(zhuǎn)基因成分含量的測定。相比ddPCR方法，qPCR需要更多的模板量和引物，加樣的數(shù)量也比較多，容易發(fā)生錯誤。采用QX200TMDroplet DigitalTMPCR系統(tǒng)，將兩套引物和探針加入到同一PCR管中，減少了加樣數(shù)量，也節(jié)省了模板量。在數(shù)據(jù)分析方面，qPCR方法需要根據(jù)熒光數(shù)值構(gòu)建標準曲線，然后通過計算獲得基因的拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)基因成分的含量；而ddPCR方法可以在電腦的分析軟件上直接讀取數(shù)據(jù)，相比之下，ddPCR方法所需時間更短，獲取數(shù)據(jù)也簡單便捷。此外，ddPCR方法檢測限可以達到2個拷貝/（20μL），ddPCR在線性范圍、檢測極限和定量極限等方面都更勝qPCR。ddPCR方法的優(yōu)點獲得越來越多的認可［22-24］，在臨床方面為癌癥、腫瘤等疾病檢測提供了新的診斷工具，被用于基因拷貝數(shù)變化分析、基因突變檢測、基因的分型等，并取得了突破性的進展［25-30］。

在轉(zhuǎn)基因檢測方面，Corbisier等［11］利用數(shù)字PCR分析了玉米種子DNA中外源基因的拷貝數(shù)，顯示與利用qPCR方法檢測的結(jié)果相同。姜羽等［20］利用ddPCR技術(shù)分析了轉(zhuǎn)基因水稻T1c-19和轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白基因山羊134外源基因的拷貝數(shù)，并與qPCR和Southern Blot方法的檢測結(jié)果進行比較，結(jié)果表明：T1c-19殺蟲晶體蛋白基因的qPCR和ddPCR測定結(jié)果比較一致，約為2個拷貝；轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白基因山羊134的qPCR和ddPCR的分析結(jié)果比較一致，HLF基因的拷貝數(shù)約為1［20］。

本研究通過建立的QX200 ddPCR體系，分析了轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2外源構(gòu)建特異性基因。ddPCR不依賴標準曲線，能夠通過不同熒光的微滴數(shù)目直接獲得靶基因的拷貝數(shù)，并精確計算出轉(zhuǎn)基因成分的含量；能夠有效節(jié)省試劑和樣品、具有更高的靈敏度，是一種精確、靈敏的轉(zhuǎn)基因生物外源基因拷貝數(shù)分析和含量測定的新方法。

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