馬立威+樊麗+倪世宇

[摘要] 目的 研究狼毒粉（EFSP）、狼毒大棗湯（DEFSJ）的單次給藥毒性反應(yīng)，為安全用藥提供參考。 方法 分別制備EFSP、DEFSJ，采用改良寇式法測(cè)定其半數(shù)致死量（LD50）及其95%可信度；并通過檢測(cè)小鼠血液生化學(xué)和組織病理學(xué)檢查評(píng)價(jià)其對(duì)小鼠肝、腎功能的影響。 結(jié)果 EFSP的LD50為2.12 g/kg，95%可信限為1.61～2.78 g/kg，DEFSJ的LD50為12.60 g/kg，95%可信限為9.65～16.48 g/kg。EFSP、DEFSJ給藥組與棗湯組比較，隨著給藥劑量的增加，體重呈顯著降低趨勢(shì)，但臟器系數(shù)變化不明顯；小鼠血液生化學(xué)結(jié)果顯示，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平均升高（P < 0.05），肌酐、血尿素氮水平有升高的趨勢(shì)；病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，兩藥對(duì)小鼠的肝、腎功能有一定的損傷。 結(jié)論 EFSP、DEFSJ均有一定的肝、腎毒性。

[關(guān)鍵詞] 狼毒粉；狼毒大棗湯；改良寇式法；單次給藥毒性

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）01（b）-0004-06

[Abstract] Objective To study single drug toxicity of Euphorbia fischeriana Steud Powder （EFSP） and Decoction of Compatibility of Euphorbia fischeriana Steud and Jujubae （DEFSJ） and provide a reference for safe medication. Methods Modified Karber method was adopted to detect lethal dose 50 （LD50） and the 95% confidence interval of EFSP and DEFSJ. Blood biochemistry and histopathology were detected to evaluate the toxicity of EFSP and DEFSJ on liver and kidney of mice. Results The LD50 of EFSP was 2.12 g/kg， and the average 95% confidence interval was 1.61-2.78 g/kg. The LD50 of DEFSJ was 12.60 g/kg， and the average 95% confidence interval was 9.65-16.48 g/kg. Compared with the Jujubae Decoction group， as the dosage was increased， the mice weight was significantly decreased， however， organ coefficient was not obviously changed in EFSP and DEFSJ groups. The blood biochemical results showed that the levels of alanine transaminase and aspartate transaminase were elevated （P < 0.05）， and the levels of creatinine and blood urea nitrogen had an increased tendency. Pathological changes of kidney and liver were found by histopathological examination. Conclusion Both EFSP and DEFSJ have definite toxicity on kidney and liver.

[Key words] Euphorbia fischeriana Steud Powder； Decoction of Compatibility of Euphorbia fischeriana Steud and Jujubae； Modified Karber methods； Single dose toxicity

狼毒粉（EFSP）中的狼毒為大戟科植物狼毒大戟的干燥根；狼毒大戟是中藥狼毒的主流產(chǎn)品；狼毒大戟主要分布于東北、河北和河南等省區(qū)，資源豐富，藥源充足。狼毒大戟始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，因其具有散結(jié)、逐水、止痛、殺蟲等功能，臨床用于治療腫瘤、結(jié)核病和皮膚病等，在民間兼用作植物殺蟲劑，用于防治螟蟲、蚜蟲、地蛆等[1-2]。狼毒大棗湯（DEFSJ）為中藥狼毒大戟和大棗按一定比例混合，經(jīng)浸泡、煎煮、濃縮后制成的湯劑；民間有偏方用狼毒蒸大棗，食其棗來治療實(shí)體瘤，但目前尚沒有這方面的文獻(xiàn)報(bào)道；有報(bào)道[3]，自制DEFSJ臨床應(yīng)用治療關(guān)節(jié)炎、黃水、銀屑病、淋巴腺結(jié)核等；關(guān)于其毒性，也有文獻(xiàn)報(bào)道，患者服用其治療銀屑病出現(xiàn)中毒的現(xiàn)象[4]。本文以EFSP、DEFSJ為研究藥物，觀察其對(duì)小鼠的單次給藥毒性作用，為其進(jìn)一步的臨床開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

大棗（陜西綠音狗頭棗）；狼毒大戟（道地藥材，采于黑龍江省泰康縣）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒（羅氏，REF 20764957，LOT 621149-01）；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒（羅氏，REF 20764949，LOT 618503-01）；肌酐（Cr）試劑盒（羅氏，REF 03263991，LOT 617550-01）；尿素氮（BUN）試劑盒（羅氏，REF 04460715，LOT 120125-01）；SPF級(jí)鼠糧及墊料（北京科奧協(xié)力飼料有限公司）。endprint

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

R-220型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士，BUCHI公司）；NLD-6DJ型細(xì)胞破壁機(jī)（中國(guó)，濟(jì)南納力德超微粉碎技術(shù)有限公司）；cobasc311型全自動(dòng)生化分析儀（瑞士，羅氏）；AL204型電子天平（德國(guó)，梅特勒-托利多公司）；BXF53型顯微鏡（日本，OLYMPUS）；VIP5型全自動(dòng)組織脫水機(jī)（日本，櫻花醫(yī)療科技有限公司）；TEC5型組織包埋機(jī)（日本，櫻花醫(yī)療科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，飼養(yǎng)室環(huán)境溫度控制在（22±3）℃，相對(duì)濕度60%，12 h光暗周期，小鼠飼養(yǎng)按照SPF動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)范進(jìn)行，4～5周齡，雌雄各半，體重18～22 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，生產(chǎn)許可證：SCXK（黑）2013-001，飼養(yǎng)于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)許可證：SYXK（黑）2016-001，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)藥物的制備

1.4.1.1 棗湯的制備 取大棗1 kg，加水10 L浸泡，煎煮，過濾后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得濃縮液2 L。

1.4.1.2 EFSP的制備 取狼毒大戟干燥根若干，粉碎后經(jīng)細(xì)胞破壁機(jī)打成超微粉，稱取超微粉10 g，以棗湯為溶劑溶解，加100 mL棗湯，相當(dāng)生藥量為0.1 g/mL，混合均勻后，備用。

1.4.1.3 DEFSJ的制備 取新鮮狼毒若干，與大棗和蒸餾水按照質(zhì)量比1∶1∶10的比例混合，取狼毒1 kg，大棗1 kg，加水10 L，浸泡30 min，煎煮2 h/次，共煎煮2次，過濾后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮2 L后，備用（參照EFSP制備，棗湯相當(dāng)溶劑，生藥量為0.5 g/mL）。

1.4.2 單次給藥毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)

取小鼠若干只，雌雄各半，禁食12 h，不禁水，按照藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法[5]，找到EFSP和DEFSJ對(duì)應(yīng)的最小給藥劑量（Dmin）值及最大給藥劑量（Dmax）值。最后得到，EFSP的Dmin值為0.37 g/kg，Dmax值為6.00 g/kg；DEFSJ的Dmin值為1.88 g/kg，Dmax值為30.00 g/kg。

1.4.3 單次給藥毒性正式實(shí)驗(yàn)分組及給藥

按預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，EFSP和DEFSJ的正式實(shí)驗(yàn)均分7個(gè)劑量組（空白組、棗湯組和5個(gè)藥物組），每組12只，雌雄各半?？瞻捉M給予生理鹽水，EFSP各劑量組依次為0.37、0.75、1.50、3.00、6.00 g/kg；DEFSJ各劑量組依次為1.88、3.75、7.50、15.00、30.00 g/kg；給藥后連續(xù)觀察14 d，其間記錄各劑量組小鼠藥后的毒性反應(yīng)及死亡情況，對(duì)死亡小鼠及時(shí)尸檢，并肉眼觀察臟器的變化情況；同時(shí)于給藥第4、9、14天測(cè)定各劑量組存活小鼠體重；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死取各劑量組存活小鼠，眼球取血，分離血清，上全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定相關(guān)生化指標(biāo)；并取其組織（心、肝、脾、肺、腎）稱重，臟器系數(shù)按照公式臟器質(zhì)量（g）/體重（kg）計(jì)算；同時(shí)取各組小鼠的肝、腎組織，多聚甲醛固定后，HE染色，光鏡下觀察其組織病理學(xué)變化情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EFSP的單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 給藥后觀察

小鼠接受單劑量EFSP后約30 min出現(xiàn)不同程度的中毒及死亡中毒小鼠主要表現(xiàn)為躁動(dòng)后安靜、而后出現(xiàn)抽搐、痙攣、呼吸急促等；給藥后25 min開始出現(xiàn)死亡，動(dòng)物死亡時(shí)間大多集中在藥后6 h內(nèi)，個(gè)別劑量組出現(xiàn)在2～3 d內(nèi)。隨著劑量的遞減癥狀減輕，死亡率降低，各劑量組存活動(dòng)物給藥后第4天開始逐漸恢復(fù)，存活動(dòng)物連續(xù)觀察至藥后14 d，動(dòng)物一般狀況較好，無明顯異常。空白組及棗湯組小鼠活動(dòng)自由，大小便正常，無任何中毒表現(xiàn)；對(duì)死亡小鼠進(jìn)行大體解剖肉眼觀察，個(gè)別小鼠肝臟呈現(xiàn)發(fā)黑，腎臟有腫脹的現(xiàn)象，其他臟器無明顯變化。

2.1.2 對(duì)體重的影響

給藥前各劑量組小鼠體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。給藥后，與空白組比較，棗湯組在第4、14 天時(shí)體重升高，在第9天時(shí)體重降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；與棗湯組比較，EFSP 0.75 g/kg組在第4天時(shí)，及EFSP 1.50、3.00 g/kg組在第4、9、14天時(shí)體重均下降，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表1。

2.1.3 對(duì)血液生化學(xué)的影響

與空白組比較，棗湯組AST、Cr值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），ALT、BUN值升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；與棗湯組比較，EFSP 0.37、0.75、1.50、3.00 g/kg組ALT、AST、Cr、值及EFSP 1.50、3.00 g/kg組BUN值均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

2.1.4 對(duì)臟器系數(shù)的影響

與棗湯組比較，EFSP 3.00 g/kg組的心、脾系數(shù)值增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表3。

2.1.5 組織病理學(xué)HE染色檢測(cè)結(jié)果

空白組與棗湯組，肝組織中肝竇數(shù)量多且清楚，肝小葉界限明顯；EFSP 0.37 g/kg組，肝組織未見明顯異常，EFSP 0.75、1.50、3.00 g/kg組小鼠肝臟均可見不同程度的肝小葉結(jié)構(gòu)消失，界限模糊不清，肝細(xì)胞可見較多的顆粒變性，胞質(zhì)疏松化，肝竇變窄，出現(xiàn)壞死灶?？瞻啄I組織中腎小管排列整齊，腎小球清晰；EFSP 0.37、0.75 g/kg組腎組織未見明顯異常，EFSP 1.50、3.00 g/kg組小鼠腎臟切片均可見腎小管上皮細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的水腫，部分腎小球體積增大，細(xì)胞數(shù)目增多。見圖1。endprint

2.1.6 小鼠死亡情況及LD50、95%可信限

EFSP各劑量組的小鼠死亡分布見表4。

2.2 DEFSJ單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 給藥后觀察

各劑量組給藥后情況同“2.1.1”。

2.2.2 對(duì)體重的影響

給藥前各劑量組小鼠體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。給藥后，與空白組比較，棗湯組在4、9、14 d時(shí)體重升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；與棗湯組比較，DEFSJ 1.88 g/kg組在4 d時(shí)，DEFSJ 3.75 g/kg組在14 d時(shí)，DEFSJ 7.50 g/kg組在9、14 d時(shí)及DEFSJ 15.00 g/kg組在4、9、14 d時(shí)體重均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表5。

2.2.3 對(duì)血液生化學(xué)影響

與空白組比較，棗湯組ALT、AST、Cr、BUN值升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；與棗湯組比較，DEFSJ 1.88、3.75、7.50、15.00 g/kg組ALT、AST、Cr值及DEFSJ 15.00 g/kg組BUN值均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表6。

2.2.4 對(duì)臟器系數(shù)影響

與棗湯組比較，DEFSJ 7.50、15.00 g/kg組的心、脾系數(shù)及DEFSJ 15.00 g/kg組的肺系數(shù)值增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表7。

2.2.5 組織病理學(xué)HE染色檢測(cè)結(jié)果

空白組與棗湯組的肝、腎組織病理學(xué)結(jié)果正常，DEFSJ 1.88、3.75 g/kg組肝組織未見明顯異常，DEFSJ 1.88、3.75、7.50 g/kg組腎組織未見明顯異常，DEFSJ 7.50、15.00 g/kg組肝組織及DEFSJ 15.00 g/kg組腎組織理學(xué)檢測(cè)變化情況同“2.15”，結(jié)果同圖1。

2.2.6 小鼠死亡情況及LD50、95%可信限

各劑量組的小鼠死亡分布見表8。

3 討論

隨著中草藥的廣泛應(yīng)用，由于配伍不當(dāng)或某些藥物劑量過大等原因，中藥的毒副作用也越來越引起大家的關(guān)注[6-8]。狼毒大戟性苦寒，有毒，為峻下逐水藥，亦有保護(hù)肝細(xì)胞和促進(jìn)肝功能恢復(fù)等多種藥理功效[9-11]。臨床上常配伍大棗使用治療肝癌、乳腺癌等腫瘤性疾病，大棗甘緩和中，益氣和胃，能減少脾胃對(duì)毒性藥物的反應(yīng)，使攻下而不傷正，能緩和狼毒大戟峻猛的藥性，減其毒性[12-13]。也有文獻(xiàn)報(bào)道，大棗味甘、性濕，功能補(bǔ)脾和胃，益氣生津，滋心潤(rùn)肺，養(yǎng)血安神，悅顏色，通九竅，助十二經(jīng)，和百藥，久服輕身延年，與狼毒合用，強(qiáng)療效，預(yù)防復(fù)發(fā)并緩解狼毒的毒性及對(duì)胃腸的刺激作用[14]；但其是否確能降低大戟科植物的毒性目前未能得到證實(shí)[15]。

目前，對(duì)狼毒大戟藥材的研究多集中在化學(xué)成分的提取和分離，主要有二萜、三萜、鞣質(zhì)、甾醇、蒽醌類等[16-19]。本研究所用藥液為狼毒大戟原藥磨成細(xì)粉與棗湯混合和狼毒大戟與大棗的水煎劑兩種形式，來探討狼毒大戟與大棗配伍使用的毒性大??；最終得到，EFSP的LD50為2.12 g/kg，95%可信限為1.61～2.78 g/kg；DEFSJ的LD50為12.60 g/kg，95%可信限為9.65～16.48 g/kg；狼毒大戟中萜類成分較多，二萜類化合物為主要活性成分[18]；萜類化合物主要存在于石油醚、乙酸乙酯等有機(jī)相提取物中，本研究中所用的DEFSJ為水煎劑，EFSP中的狼毒為原植物粉，故對(duì)比而言DEFSJ的毒性比EFSP??；而對(duì)于傳統(tǒng)中藥而言水煎劑使用更廣泛，更具有實(shí)用意義，故本研究藥液采用水煎劑形式。本研究中隨著給藥劑量的增加，小鼠體重變化較明顯，由于體重變化的顯著而多數(shù)臟器在給藥后較短的時(shí)間內(nèi)重量變化不太明顯，導(dǎo)致小鼠的臟器系數(shù)出現(xiàn)無規(guī)律的變化；但病理學(xué)及生化學(xué)結(jié)果均證實(shí)兩藥有一定的肝、腎毒性。

綜上所述，EFSP和DEFSJ兩藥均有一定毒性；本研究只起到為臨床狼毒大戟的安全用藥提供參考的作用，具體狼毒大戟與大棗配伍后是否真正達(dá)到減毒、強(qiáng)療效的作用還有待進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 王宏偉，王海香，顧雅靜.狼毒大戟化學(xué)成分和藥效作用研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012，24（5）：1853-1856.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

[3] Yang XK，Xu MY. In vitro and in vivo Antitumor Activity of Scute barbatine on Human Lung Carcinoma A549 cell line [J]. Molecules，2014，19（7）：8740-8751.

[4] 王蒙，李靜，魏晴，等.狼毒大戟中松香烷型二萜內(nèi)酯的抗腫瘤活性研究[J].中國(guó)藥師，2015，18（8）：1260-1262.

[5] 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：201-203.

[6] 張季林，陳蘭英.中藥毒性產(chǎn)生的原因分析[J].江西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，28（1）：15-17.

[7] 任小巧，高增平，穆麗莎.中藥新藥毒性與抗癌效應(yīng)研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，30（200）：7-10.

[8] 洪博，李文靜，劉吉成，等.狼毒大戟配伍大棗合煎液與單煎液主要成分含量的比較研究[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2017，37（15）：1444-1447.

[9] 蔡珍珍，金銘，楊盼盼，等.狼毒大戟石油醚提取物對(duì)小鼠肝臟細(xì)胞凋亡及p-ERK、Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋白酶-3的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2016，36（1）：1-5.

[10] 吳宏輝，李紅麗，王文全，等.瑞香狼毒抗癌作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2016，23（11）：127-130.

[11] 周躍華，路金才.關(guān)于大毒藥材的范圍及相關(guān)問題探討[J].中草藥，2016，47（1）：149-156.

[12] 李文靜，興桂華，劉軍，等.狼毒大戟配伍大棗對(duì)誘導(dǎo)肝硬化大鼠的抵抗作用及機(jī)制[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（21）：117-123.

[13] 宗倩倩，唐于平，沈祥春，等.大戟科中藥材的毒性作用研究進(jìn)展[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24（4）：283-285.

[14] 袁進(jìn)國(guó)，于明克，王子文，等.自制狼毒大棗湯治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎108例分析[J].中國(guó)誤診學(xué)雜志，2006，12（6）：2347-2348.

[15] 徐麗，尚爾鑫，沈祥春，等.大戟配伍大棗減毒相關(guān)化學(xué)物質(zhì)的初步研究[J].安徽醫(yī)藥，2010，14（7）：758-759.

[16] Wang HB，Chen W，Zhang YY，et al. Four new diterpeno?ids from the roots of Euphorbia fischeriana [J]. Fitoterapia，2013，91：211-216.

[17] Wang XY，Liu LP，Kang TG，et al. Chemical constituents of Euphorbia fischeriana [J]. Chinese Journal of Natural Medicines，2012，10（4）：299-302.

[18] 洪博，李文靜，劉樹民，等.狼毒大戟二萜類成分HPLC指紋圖譜及聚類分析[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015， 27（4）：617-620.

[19] 王楠，劉建雙，王丹，等.狼毒大戟中三萜類成分的研究[J].齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，33（4）：59-61.

（收稿日期：2017-10-05 本文編輯：張瑜杰）endprint