陳俊林+黃飛+徐費(fèi)凡

[摘要] 目的 探討Xpert MTB/RIF與BACTEC MGIT960在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌（MTB）及利福平（RFP）耐藥性出現(xiàn)差異的原因。方法 選擇2014年6月～2017年6月在南通市第六醫(yī)人民院就診的188例復(fù)治肺結(jié)核患者的涂陽(yáng)痰標(biāo)本作為研究對(duì)象，分別采用Xpert MTB/RIF及BACTEC MGIT960檢測(cè)MTB及RFP耐藥性并結(jié)合患者用藥史對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果 兩種方法檢測(cè)出一致性結(jié)果146例，差異性結(jié)果38例。使用過(guò)含利福霉素類藥物且用藥時(shí)間>3個(gè)月病例組，Xpert MTB/RIF檢測(cè)出的RFP耐藥性病例數(shù)高于BACTEC MGIT960，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 = 6.31，P < 0.05），其余各組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)論 Xpert MTB/RIF與BACTEC MGIT960檢測(cè)涂陽(yáng)痰標(biāo)本MTB及RFP耐藥性會(huì)出現(xiàn)部分差異性結(jié)果，可能與患者的用藥史有關(guān)，臨床醫(yī)師應(yīng)重視兩種檢查方法的差異性并準(zhǔn)確制訂抗結(jié)核治療方案。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核分枝桿菌；利福平；藥敏試驗(yàn)；XpertMTB/RIF；BACTEC MGIT960

[中圖分類號(hào)] R563.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）01（a）-0049-04

[Abstract] Objective To explore the differences between Xpert MTB/RIF and BACTEC MGIT960 in detecting Mycobacterium tuberculosis （MTB） and Rifampin （RFP） resistance. Methods From June 2014 to June 2017， sputum specimens from 188 retreated smear positive pulmonary tuberculosis patients in the Sixth People's Hospital of Nantong were selected as research objects. Xpert MTB/RIF and BACTEC MGIT960 were used to detect MTB in the sputum specimens of the patients and the RFP resistance was analyzed combined with the medical history. Results Then were 146 cases of consistency results between Xpert MTB/RIF and BACTEC MGIT960 in detecting MTB， while 38 cases of heterogeneity. The number of cases in Xpert MTB/RIF group was higher than that of BACTEC MGIT960 group in the use of the drug with rifamycin and the duration above 3 months， with statistically significant difference （χ2=6.31，P < 0.05）. There were no statistically significant differences between Xpert MTB/RIF and BACTEC MGIT960 in the comparison of other medical history groups （P > 0.05）. Conlusion The results of Xpert MTB/RIF and BACTEC MGIT960 in detecting MTB and RFP resistance from sputum specimens of smear positive are differential. It may be associated with medical history of the patients. Clinical physicians should pay attention to the differences of the two detection methods and formulate anti-tuberculosis treatment plan accurately.

[Key words] Mycobacterium tuberculosis； Rifampicin； Drug sensitive test； XpertMTB/RIF； BACTEC MGIT960

耐利福平（RFP）結(jié)核?。∕TB）的診治仍然是國(guó)內(nèi)外關(guān)注的重點(diǎn)[1-2]，本地區(qū)疾控機(jī)構(gòu)流行病學(xué)調(diào)查顯示，耐RFP結(jié)核病近幾年呈明顯上升趨勢(shì)[3]。如果能在就診的肺結(jié)核患者中快速、準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)耐RFP的MTB并及時(shí)更改抗結(jié)核治療方案，就可以避免低濃度耐藥MTB演變?yōu)楦邼舛饶退嶮TB并獲得穩(wěn)定遺傳和繁殖。傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)及比例法藥敏技術(shù)雖然是結(jié)核菌耐藥檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但檢測(cè)需耗時(shí)1～2個(gè)月，不能滿足臨床需要。BACTEC MGIT960檢測(cè)MTB及藥物敏感性和傳統(tǒng)的羅培藥敏高度一致，耗時(shí)僅需要半月左右，可替代傳統(tǒng)培養(yǎng)及藥敏檢測(cè)[4-5]。目前流行的XpertMTB/RIF技術(shù)檢測(cè)標(biāo)本中MTB及RFP耐藥僅需要幾小時(shí)就能報(bào)告結(jié)果，已在臨床應(yīng)用中得到高度評(píng)價(jià)[6-7]。但實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)XpertMTB/RIF技術(shù)和BACTEC MGIT960在MTB及RFP耐藥性檢測(cè)方面存在一定差異，可能會(huì)對(duì)制訂抗結(jié)核方案帶來(lái)困惑?；谝陨显颍P者對(duì)近3年采用這兩種檢測(cè)方法所得到結(jié)果進(jìn)行了比較?，F(xiàn)報(bào)道如下：endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 菌株來(lái)源 MTB標(biāo)準(zhǔn)株（H37Rv ATCC27294）購(gòu)自國(guó)家菌種保藏中心，188例涂陽(yáng)痰標(biāo)本來(lái)自2014年6月～2017年6月在南通市第六人民醫(yī)院就診的復(fù)治肺結(jié)核患者。其中男115例，女73例，年齡27～82歲，平均（50.7±2.0）歲。對(duì)每例復(fù)治涂陽(yáng)肺結(jié)核患者均詳細(xì)記錄用藥史、癥狀及胸部CT檢查情況。

1.1.2 主要試劑和儀器 RFP購(gòu)自美國(guó)Fluka公司；Bactec MGIT檢測(cè)儀、Bactec MGIT試劑、61010A-1型比濁儀購(gòu)自美國(guó)BD（Becton Dickinson）公司；GNP-92700隔水式培養(yǎng)箱購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GeneXpert儀器及Xpert MTB/RIF檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cepheid公司。

1.2 方法

1.2.1 抗酸染色涂片檢測(cè) 按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[8]中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序進(jìn)行操作。報(bào)告方式：100倍物鏡按1+～4+進(jìn)行分級(jí)。

1.2.2 標(biāo)本處理 取干酪樣或膿樣晨痰1 mL于試管內(nèi)，加入4 mL 4%NaOH并進(jìn)行振蕩使痰液充分消化，移入37℃水浴箱，15 min后用1 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中和，3000 r/min 離心30 min后移入37℃水浴電熱恒箱內(nèi)。

1.2.3 BACTEC MGIT960 按照BACTEC MGIT960操作說(shuō)明，吸取0.5 mL標(biāo)本處理液加入到MGIT液體培養(yǎng)管中進(jìn)行MTB培養(yǎng)，取陽(yáng)性第3天～第5天培養(yǎng)管，無(wú)菌吸取1 mL陽(yáng)性肉湯至4 mL無(wú)菌生理鹽水中作為稀釋菌液，再以此稀釋菌液1∶100稀釋作為對(duì)照菌液，分別以無(wú)菌方法加入500 μL對(duì)照菌液和稀釋菌液于BACTEC MGIT960對(duì)照管及加有RFP的藥物培養(yǎng)管中顛倒混勻（培養(yǎng)基的藥物濃度為1.0 mg/mL）。放入BACTEC MGIT960培養(yǎng)箱中，15 d之內(nèi)儀器自動(dòng)報(bào)告敏感與耐藥結(jié)果。質(zhì)量控制：每次藥敏試驗(yàn)均采用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株作為陽(yáng)性參照，進(jìn)行分枝桿菌液體培養(yǎng)及RFP藥敏試驗(yàn)（其中RFP培養(yǎng)基的藥物濃度為1.0 mg/mL），儀器在15 d之內(nèi)自動(dòng)報(bào)告敏感與耐藥結(jié)果。

1.2.4 XpertMTB/RIF核酸擴(kuò)增檢測(cè) 按試劑說(shuō)明書(shū)將之前處理后標(biāo)本加入檢測(cè)反應(yīng)盒，上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行核酸提取、擴(kuò)增，目標(biāo)序列的檢測(cè)和結(jié)果判斷。2 h內(nèi)判斷患者是否患有結(jié)核及是否對(duì)RFP耐藥。反應(yīng)結(jié)束后，在檢測(cè)系統(tǒng)窗口下直接觀察測(cè)試結(jié)果[9]。結(jié)果報(bào)告：MTB檢出或未檢出。MTB檢出報(bào)告同步顯示RFP耐藥的結(jié)果：△CT≥3.5，RFP耐藥；△CT<3.5，RIF敏感（CT是指探針循環(huán)域值，△CT指探針早期CT值與晚期CT值之差）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 188例涂陽(yáng)痰標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果

BACTEC MGIT960培養(yǎng)陰性20例，陽(yáng)性168例；4例鑒定為非結(jié)核分枝桿菌，164例為結(jié)核分枝桿菌；藥敏結(jié)果顯示，耐RFP 46例。Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性177例；檢出耐RFP 68例。兩種方法同時(shí)檢出MTB 159例，均報(bào)告為陰性 2例，同時(shí)診斷RFP耐藥為40例。

2.2 BACTEC MGIT960與XpertMTB/RIF檢測(cè)結(jié)果的差異比較

兩種方法檢測(cè)出RFP敏感或耐藥一致性結(jié)果146例，差異性結(jié)果38例。2例標(biāo)本BACTEC MGIT960培養(yǎng)陽(yáng)性而Xpert MTB/RIF檢出陰性，藥敏報(bào)告提示對(duì)RFP敏感；18例BACTEC MGIT960培養(yǎng)陰性而Xpert MTB/RIF檢出陽(yáng)性標(biāo)本，16例Xpert MTB/RIF檢出RFP耐藥；6例BACTEC MGIT960檢測(cè)提示，RFP耐藥而Xpert MTB/RIF檢測(cè)提示RFP敏感；12例BACTEC MGIT960檢測(cè)顯示RFP敏感而Xpert MTB/RIF檢測(cè)提示RFP藥耐。

2.3 BACTEC MGIT960及XpertMTB/RIF檢測(cè)RFP耐藥差異性與患者用藥史的關(guān)系

剔除4例鑒定為非MTB患者及2例用藥史不詳患者，對(duì)182例患者留痰時(shí)所記錄的用藥時(shí)間、用藥種類進(jìn)行分組，分別記錄各組痰標(biāo)本使用BACTEC MGIT960及XpertMTB/RIF檢測(cè)RFP耐藥結(jié)果。用藥時(shí)間>3個(gè)月（含利福霉素類）痰標(biāo)本組，Xpert MTB/RIF檢測(cè)出的RFP耐藥性病例數(shù)高于BACTEC MGIT960，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 = 6.31，P < 0.05）。其余各組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

XpertMTB/RIF和BACTEC MGIT960分別作為分子藥敏檢測(cè)技術(shù)代表和表型藥敏檢測(cè)技術(shù)代表，技術(shù)原理均非常明確，已推廣應(yīng)用于臨床快速檢測(cè)MTB及耐藥性中。兩者在檢測(cè)MTB臨床分離株及RFP耐藥性方面有極高的符合率[10-12]。但本研究發(fā)現(xiàn)，在直接檢測(cè)臨床痰標(biāo)本中，MTB及RFP耐藥性存在一定差異，如果不能正確判讀結(jié)果，可能因漏診或誤診而造成誤診誤治，將無(wú)法實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療而影響其身心健康。

有文獻(xiàn)報(bào)道，BACTEC MGIT960檢出MTB最低限量為1～10 CFU/mL，而Xpert MTB/RIF檢測(cè)MTB最低限量為100 CFU/mL[13]，提示BACTEC MGIT960對(duì)微量MTB的檢出能力具有優(yōu)越性。但BACTEC MGIT 960僅能對(duì)標(biāo)本中活菌進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)已死亡的MTB則無(wú)法檢測(cè)，對(duì)活力極弱的MTB如休眠菌則檢出能力下降，而Xpert MTB/RIF檢測(cè)的標(biāo)靶為MTB特有的DNA片段，對(duì)活菌或DNA未降解的死亡MTB均具有檢測(cè)能力。本組部分病例已經(jīng)過(guò)有效抗結(jié)核治療，雖然痰涂片仍然陽(yáng)性，但MTB可能已死亡或接近死亡，會(huì)出現(xiàn)BACTEC MGIT960培養(yǎng)陰性而Xpert MTB/RIF檢出陽(yáng)性，能很好地解釋本研究中Xpert MTB/RIF比BACTEC MGIT960檢出率更高的反差現(xiàn)象。另外，在復(fù)治肺結(jié)核患者中，結(jié)核分枝桿菌L型（MTB-L）存在比例非常高[14-15]，MTB-L不易被結(jié)核藥物清除，經(jīng)過(guò)治療后的痰標(biāo)本中可能同時(shí)存在死亡MTB和活的MTB-L，因培養(yǎng)條件不同可以出現(xiàn)導(dǎo)致表型藥敏技術(shù)和分子藥敏技術(shù)檢測(cè)結(jié)果不一致的現(xiàn)象，這就要求仔細(xì)分析病史及用藥史才能分析兩種方法檢測(cè)MTB出現(xiàn)不一致結(jié)果的可能原因。endprint

從檢測(cè)耐藥性能看，BACTEC MGIT960是現(xiàn)今最好的自動(dòng)化MTB表型藥敏檢測(cè)系統(tǒng)，能檢出標(biāo)本中微量耐藥MTB，但對(duì)死亡的MTB、休眠M(jìn)TB、MTB-L等無(wú)法進(jìn)行藥敏檢測(cè)。XpertMTB/RIF所采用精密設(shè)計(jì)的分子探針能高效檢測(cè)到rpoB核心區(qū)基因突變情況，而rpoB基因具有鑒定RFP耐藥菌株的能力[16-17]。理論上XpertMTB/RIF對(duì)活的MTB、MTB-L或DNA未降解的死亡MTB均具有RFP耐藥檢測(cè)能力，基本涵蓋MTB各種可能存在狀態(tài)，因此僅有XpertMTB/RIF報(bào)告檢測(cè)到送檢標(biāo)本中存在耐藥菌而MGIT960培養(yǎng)陰性或者報(bào)告對(duì)RFP敏感，要謹(jǐn)慎改變治療方案。如果標(biāo)本中存在異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象[18]，rpoB基因發(fā)生突變的MTB比例過(guò)低，Xpert MTB/RIF可能無(wú)法檢測(cè)到耐RFP的MTB而B(niǎo)ACTEC MGIT960檢測(cè)到對(duì)RFP耐藥MTB，可能要對(duì)治療方案進(jìn)行調(diào)整。

本研究結(jié)果顯示，使用XpertMTB/RIF技術(shù)和BACTEC MGIT960在MTB及RFP耐藥性檢測(cè)方面存在一定差異，與復(fù)治涂陽(yáng)肺結(jié)核患者是否使用了包含RFP抗結(jié)核藥物組成的方案及用藥時(shí)間有一定相關(guān)性。正是因?yàn)榛颊咚蜋z痰標(biāo)本的時(shí)間節(jié)點(diǎn)不同，即有的患者送痰標(biāo)本時(shí)未開(kāi)始接受治療，有的正在接受治療或有的已經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間治療，有的治療方案中包含RFP，這時(shí)痰標(biāo)本中MTB存在狀態(tài)可能出現(xiàn)多樣性，最終導(dǎo)致了BACTEC MGIT960和XpertMTB/RIF檢測(cè)結(jié)果的差異性。因此，當(dāng)快速取得Xpert MTB/RIF檢測(cè)報(bào)告時(shí)，要謹(jǐn)慎判讀檢測(cè)結(jié)果，最好結(jié)合用藥史或者等待BACTEC MGIT960藥敏檢測(cè)結(jié)果再合理調(diào)整治療方案[19]。但BACTEC MGIT960藥敏檢測(cè)同XpertMTB/RIF相比較仍耗時(shí)較長(zhǎng)，不能充分滿足臨床診斷需要，因此，建議有條件的?？漆t(yī)院可同時(shí)進(jìn)行MTB-L和結(jié)核RNA檢測(cè)。MTB-L培養(yǎng)鑒定需要較長(zhǎng)時(shí)間，僅能作為最終抗結(jié)核方案調(diào)整依據(jù)，而要快速準(zhǔn)確解讀Xpert MTB/RIF檢測(cè)報(bào)告意義，同時(shí)檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核RNA是非常理想的方法。目前檢測(cè)結(jié)核RNA的新技術(shù)SAT-TB[20]，其技術(shù)原理是以MTB特異的16srRNA為檢測(cè)靶標(biāo)，通過(guò)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增RNA靶標(biāo)片段，對(duì)熒光標(biāo)記的探針與靶標(biāo)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后釋放出熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)得到陽(yáng)性結(jié)果，從臨床標(biāo)本處理到最終報(bào)告結(jié)果僅需幾小時(shí)，從而快速準(zhǔn)確地判斷待檢樣本中是否有MTB存在。SAT-TB與基于DNA為模板的核酸擴(kuò)增技術(shù)如XpertMTB/RIF相比，該技術(shù)只檢測(cè)活的MTB，因?yàn)镸TB死亡后RNA便降解[21]，但DNA存在于活和死亡的MTB中，因此使用SAT-TB技術(shù)檢測(cè)RNA能彌補(bǔ)XpertMTB/RIF不能區(qū)別死菌與活菌的缺陷，提高快速準(zhǔn)確診斷能力。

本研究?jī)H統(tǒng)計(jì)了兩種方法檢測(cè)涂陽(yáng)痰標(biāo)本的結(jié)果，沒(méi)有將涂陰培陽(yáng)或涂陰培陰標(biāo)本納入，是為了便于對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行客觀分析。因檢測(cè)樣本有限，需要更大樣本來(lái)驗(yàn)證相關(guān)數(shù)據(jù)?？傊?，因痰標(biāo)本中MTB存在狀態(tài)可能會(huì)導(dǎo)致BACTEC MGIT960及XpertMTB/RIF檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)一定差異，關(guān)鍵是對(duì)得到的差異結(jié)果進(jìn)行認(rèn)真判斷，避免誤診或漏診。

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（收稿日期：2017-09-28 本文編輯：王 娟）endprint