林 云,林 娟,王國增,林夢丹,葉秀云

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,福建省海洋酶工程重點實驗室,福建 福州 350116)

0 引言

α-淀粉酶(1,4-α-D-葡萄糖苷水解酶,EC3.2.1.1)是一種內(nèi)切淀粉酶,可隨機(jī)切斷淀粉、 糖原等內(nèi)部的α-1,4糖苷鍵,得到末端殘基碳原子為α構(gòu)型的水溶性糊精和低聚糖[1-3]. 根據(jù)最適反應(yīng)溫度的不同,可將α-淀粉酶分為低溫、 中溫和高溫α-淀粉酶[4]. 其中,中溫α-淀粉酶的最適反應(yīng)溫度在50～70 ℃左右,60 ℃以下較穩(wěn)定,最適pH值在6.0左右[5],可應(yīng)用于面包、 果汁、 葡萄糖、 味精等多種食品的生產(chǎn),也可用于絲綢、 人造棉、 化學(xué)纖維的退漿等[3, 6-7].

能產(chǎn)生α-淀粉酶的微生物主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)[8]、 米曲霉(Aspergillusoryzae)[9]、 施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)[10]等. 目前大多數(shù)國家的酶制劑產(chǎn)品[11-13]以芽孢桿菌產(chǎn)的細(xì)菌型淀粉酶和米曲霉產(chǎn)的真菌型淀粉酶為主,且最適pH值大多在酸性和中性之間[13-14]. 本研究利用基因工程方法克隆表達(dá)來源于云南騰沖溫泉地芽孢桿菌Geobacillussp.WQJ-1中的α-淀粉酶基因,并對重組蛋白進(jìn)行分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究,以期獲得pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性較好的α-淀粉酶.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

地芽孢桿菌Geobacillussp.WQJ-1從云南騰沖溫泉中篩選獲得,pMD18-T載體購于TaKaRa公司,大腸桿菌BL21(DE3)和Trans1-T1購于全式金公司,表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)為本實驗室保存.

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基： Trypton 10 g,Yeast Extract 5 g,NaCl 10 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0(配制固體培養(yǎng)基時添加20 g的瓊脂),121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min.

1.1.3 酶和試劑

DL5000 DNA Ladder Marker、 2×Pfu PCR Master Mix和細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購自TaKaRa公司； DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒(E.Z.N.A Gel Extraction Kit,D2500-01)、 質(zhì)粒小提試劑盒(E.Z.N.A Plasmid Mini Kit,D6492-01)、 PCR產(chǎn)物純化試劑盒(E.Z.N.A Cycle Pure Kit,D6492-01)均購自O(shè)mega公司； 硫酸卡那霉素購自Sigma公司； 各種限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司； T4 DNA連接酶購自NEB公司； 異丙基-β-D硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside,IPTG)購自Amresco公司； 250 ku Protein Ladder Marker、 Easy Ⅱ Protein Quantitative Kit(BCA)購自全式金公司.

1.1.4 常用溶液

表1 標(biāo)準(zhǔn)McIlvaine緩沖液的配制Tab.1 Preparation of standard McIlvaine buffer

標(biāo)準(zhǔn)McIlvaine緩沖液： 配制200 mmol·L-1的Na2HPO4溶液(A液)和100 mmol·L-1的檸檬酸溶液(B液),各緩沖液按照表1的比例配制.

Tris-HCl緩沖液： 配制50 mmol·L-1的Tris溶液,用適量HCl滴定至pH值為7.0、 8.0、 9.0； Gly-NaOH緩沖液： 配制50 mmol·L-1的甘氨酸溶液,用適量NaOH溶液滴定至pH值為9.0、 10.0.

展開劑： 正丁醇20 mL,冰乙酸10 mL,蒸餾水10 mL[15].

顯色劑： 苯胺4 mL,二苯胺4 g,磷酸20 mL,溶解于200 mL丙酮[15].

1.2 方法

1.2.1Geobacillussp.WQJ-1α-淀粉酶基因的克隆

選擇切除信號肽序列的Geobacillussp.WQJ-1α-淀粉酶基因(即成熟肽基因)進(jìn)行克隆表達(dá). 應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件,根據(jù)Geobacillussp.WQJ-1α-淀粉酶的基因序列及表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)的酶切位點設(shè)計引物,在上、 下游引物5′端分別引入SacⅠ位點和XhoⅠ位點：

上游引物(WQJ-F)： 5′-ATAGAGCTCGCCGCACCGTTTAACGGCACCATGATG-3′

下游引物(WQJ-R)： 5′-TATCTCGAGTGGCCATGCCACCAACCGTGGTTCG-3′

以Geobacillussp.WQJ-1基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增. 50 μL PCR反應(yīng)體系： 模板3 μL,2×Pfu PCR Master Mix 25 μL,引物各1.5 μL,超純水19 μL. PCR擴(kuò)增條件： 94 ℃,5 min； 94 ℃,30 s,62.1 ℃,30 s,72 ℃,90 s,30個循環(huán)； 72 ℃,3 min.

將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳確證后,利用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因.

1.2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建

用SacⅠ和XhoⅠ將純化的目的基因雙酶切并進(jìn)行DNA純化,與進(jìn)行同樣雙酶切并回收的表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)用T4 DNA連接酶于4 ℃過夜連接,得到重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化Trans1-T1細(xì)胞,經(jīng)卡那霉素篩選、 菌落PCR驗證并測序得到陽性克隆,將其接入含20 μg·mL-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37 ℃、 200 r·min-1條件下過夜培養(yǎng),用Omega公司的質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒.

1.2.3α-淀粉酶基因表達(dá)與純化

利用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21(DE3) 表達(dá)宿主細(xì)胞,經(jīng)卡那霉素篩選、 菌液PCR驗證并測序得到陽性克隆,挑取陽性克隆接入含20 μg·mL-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37 ℃、 200 r·min-1條件下過夜培養(yǎng),然后按1%的接種量接種到含相同抗生素濃度的50 mL LB培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時,加入終濃度1 mmol·L-1的IPTG,于30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h. 取培養(yǎng)物在12 000 r·min-1下離心5 min. 用5 mL 0.2 mol·L-1的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH=6.0)重懸菌體,超聲破碎(功率25%,超聲時間4 s,間隔時間5 s,超聲次數(shù)200次). 破碎后于4 ℃、 12 000 r·min-1下離心5 min,收集上清,測定酶活力大小,并將上清過鎳柱進(jìn)行純化[16].

1.2.4α-淀粉酶活力測定

取900 μL 5 mg·mL-1的可溶性淀粉溶液,于一定溫度下預(yù)熱2 min,加入100 μL酶液反應(yīng)20 min,用DNS法測定產(chǎn)生的還原糖[17]. 酶活力單位(U)定義為： 淀粉酶在合適的緩沖液、 溫度、 pH值等條件下,每分鐘從可溶性淀粉中釋放出1 μmol還原糖所需要的酶量.

1.2.5α-淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)研究

最適反應(yīng)pH值的測定： 在75 ℃條件下,分別測定α-淀粉酶在不同pH值緩沖液(pH=4.0～10.0)中的酶活力,設(shè)定最高的酶活力為100%,其余與之相比得到相對酶活力.

pH穩(wěn)定性的測定： 將酶液置于不同pH值緩沖液(pH= 4.0～10.0)中,于37 ℃條件下保溫1 h,在最適反應(yīng)條件下測定酶活力,設(shè)定最高的酶活力為100%,其余與之相比得到相對酶活力.

最適反應(yīng)溫度的測定. 在最適反應(yīng)pH值條件下,分別測定α-淀粉酶在不同溫度(50～90 ℃)條件下的酶活力,設(shè)定最高的酶活力為100%,其余與之相比得到相對酶活力.

Ca2+對α-淀粉酶熱穩(wěn)定性的影響. 在酶液中分別添加5、 10、 15 mmol·L-1Ca2+,于不同溫度(70、 75、 80 ℃)下保溫,分別在2、 3、 10、 15、 20、 30、 60 min時取樣并立即置于冰上,在最適反應(yīng)條件下測定酶活力,設(shè)定未經(jīng)過處理的酶液活力為100%,其余與之相比得到相對酶活力.

金屬離子和化學(xué)試劑對α-淀粉酶活力的影響. 在酶促反應(yīng)體系中分別加入終濃度為1和5 mmol·L-1的K+、 Na+、 Ca2+、 Li+、 Co2+、 Cr3+、 Ni2+、 Cu2+、 Mg2+、 Fe2+、 Mn2+、 Zn2+、 Ag+、 Hg2+、 Al3+、 EDTA、 SDS和β-巰基乙醇,在最適反應(yīng)條件下測定酶活力,設(shè)定同樣條件下未加金屬離子和化學(xué)試劑所測得的酶活力為100%,其余與之相比得到相對酶活力.

α-淀粉酶動力學(xué)參數(shù)的測定. 根據(jù)李寧[18]的方法,測定反應(yīng)的一級反應(yīng)時間為10 min. 配制不同濃度可溶性淀粉底物(1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5、 4.0、 4.5、 5.0 mg·mL-1),在最適反應(yīng)條件下測定酶活力,計算反應(yīng)速度,利用Lineweaver-Burk 法[19]求得Km值及vmax.

α-淀粉酶的底物特異性. 分別以5 mg·mL-1的可溶性淀粉、 木薯淀粉、 馬鈴薯淀粉、 玉米淀粉、 糊精(玉米)、β-環(huán)狀糊精、 普魯蘭多糖為底物,在最適反應(yīng)條件下測定酶活力,設(shè)定以可溶性淀粉為底物測得的酶活力為100%,其余與之相比得到相對酶活力.

α-淀粉酶水解產(chǎn)物的分析. 用最適反應(yīng)pH值的緩沖液配制5 mg·mL-1木薯淀粉溶液,向4.5 mL淀粉底物中加入0.5 mL酶液,混勻后置于最適反應(yīng)溫度下保溫不同時間,分別取樣并用硅膠板薄層色譜的方法分析[20].

2 結(jié)果與分析

2.1 Geobacillus sp.WQJ-1 α-淀粉酶基因的全長序列分析

Geobacillussp.WQJ-1α-淀粉酶基因amyWQJ全長1 614 bp,編碼537個氨基酸和一個終止密碼子,編碼的rAmyWQJ蛋白預(yù)計相對分子質(zhì)量為61.1 ku. 基因序列經(jīng)BlastN比對后,發(fā)現(xiàn)多個芽孢桿菌屬來源的α-淀粉酶基因序列與其相近； 經(jīng)BlastP分析后,發(fā)現(xiàn)rAmyWQJ蛋白序列與來源于GeobacilluskaustophilusGBlys1713273A 的α-amylase(GenBank登錄號GAD15124.1)蛋白序列一致性最高為100%； 對rAmyWQJ蛋白序列進(jìn)行多重氨基酸序列比對分析后發(fā)現(xiàn),rAmyWQJ氨基酸序列中存在α-淀粉酶家族的四個保守區(qū)段,即RegionⅠ(123DVVFDH),RegionⅡ(252GFRLDAVKH),RegionⅢ(284VGEYWS),RegionⅣ(348FVDNHD),其中Ⅱ、 Ⅲ、 Ⅳ區(qū)段分別含有Asp256、 Glu286、 Asp353三個保守催化殘基,進(jìn)一步證明該基因為α-淀粉酶基因. 用Signal P4.1分析表明rAmyWQJ蛋白N端22個氨基酸為預(yù)測的信號肽(見圖1),該編碼蛋白與PDB中的4uzu.1.A(Geobacillusstearothermophilusα-amylase)的一致性為99.42%,以此為模板,利用SWISS-MODEL同源建模的方法構(gòu)建該蛋白的3級結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖2所示,圖中卷曲結(jié)構(gòu)表示α螺旋,箭頭結(jié)構(gòu)表示β折疊,中間有2個鈣離子結(jié)合位點(黑色球).

圖1 α-淀粉酶rAmyWQJ信號肽預(yù)測Fig.1 Signal peptide prediction of α-amylase rAmyWQJ.

圖2 α-淀粉酶rAmyWQJ三維結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Three-dimensional structures of α-amylase rAmyWQJ

2.2 Geobacillus sp.WQJ-1 α-淀粉酶基因的克隆

圖3 α-淀粉酶基因的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.3 PCR amplification electrophoresis of α-amylase gene

以Geobacillussp.WQJ-1基因組DNA為模板,以WQJ-F和WQJ-R為引物,PCR擴(kuò)增α-淀粉酶成熟肽基因. 核酸電泳顯示其條帶在1 500 bp左右,與理論基因長度相符(見圖3).

割膠回收PCR產(chǎn)物,連接pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化驗證,將陽性重組子送上海英濰捷基公司測序,測序結(jié)果表明插入的序列是正確的.

2.3 原核表達(dá)載體pET-28a(+)-amyWQJ的構(gòu)建

將α-淀粉酶成熟肽基因amyWQJ連接pET-28a(+)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-amyWQJ,轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞,菌液PCR驗證后挑選陽性克隆子委托上海英濰捷基公司測序,測序結(jié)果表明插入的序列是正確的.

2.4 α-淀粉酶基因的表達(dá)與純化

圖4 純化后重組酶rAmyWQJ的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified recombinant rAmyWQJ

如圖4所示進(jìn)行純化后重組酶rAmyWQJ的SDS-PAGE分析. 利用質(zhì)粒提取試劑盒提取確證的重組載體,并將其轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)1 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白,超聲破碎、 離心,測得上清液的α-淀粉酶活力為173.0 U·mL-1； 無IPTG誘導(dǎo)時,細(xì)胞破碎液中α-淀粉酶的活力為163.1 U·mL-1,這可能是因為α-淀粉酶基因amyWQJ在大腸桿菌中存在微量表達(dá),而培養(yǎng)基中存在一些物質(zhì)可能被該酶分解,之后生成具有誘導(dǎo)作用的小分子. 同時在含空載pET-28a(+)的對照菌株中沒有檢測到α-淀粉酶活性,這說明α-淀粉酶基因amyWQJ在大腸桿菌中成功表達(dá). 經(jīng)鎳柱純化后,得到大小約59 ku的單一蛋白條帶,與該α-淀粉酶成熟蛋白的理論相對分子質(zhì)量相當(dāng).

目前商品化的α-淀粉酶主要來源于細(xì)菌和絲狀真菌,表2列出了應(yīng)用基因工程技術(shù)表達(dá)不同來源α-淀粉酶的情況,表明α-淀粉酶基因amyWQJ在大腸桿菌中得到較好的表達(dá).

表2 應(yīng)用基因工程技術(shù)表達(dá)不同來源的α-淀粉酶基因Tab.2 Applications of genetic engineering technology to express α-amylases

2.5 重組α-淀粉酶rAmyWQJ的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.5.1 pH值對重組酶rAmyWQJ活力的影響

純化后的重組α-淀粉酶rAmyWQJ的最適反應(yīng)pH值為6.0,pH值在5.0～9.0之間,可保持58.7%以上的相對酶活力(見圖5),屬于中性淀粉酶. 該酶的pH穩(wěn)定性較好,在pH值5.0～10.0的緩沖液中,于37 ℃保溫1 h,仍能保持60%以上的酶活力(見圖6).

圖5 pH值對重組酶rAmyWQJ活力的影響Fig.5 Effect of pH value on recombinant rAmyWQJ activity

圖6 重組酶rAmyWQJ的pH穩(wěn)定性Fig.6 pH stability of recombinant rAmyWQJ

2.5.2 溫度對重組酶rAmyWQJ活力的影響

圖7 溫度對重組酶rAmyWQJ酶活力的影響 Fig.7 Effect of temperature on recombinant rAmy- WQJ activity

圖7為溫度對重組酶rAmyWQJ酶活力的影響. 由圖7可見,重組酶rAmyWQJ的最適反應(yīng)溫度為70 ℃,表明該酶為中溫淀粉酶.

2.5.3 Ca2+對重組酶rAmyWQJ熱穩(wěn)定性的影響

α-淀粉酶含有一個以上的Ca2+結(jié)合位點,Ca2+的存在可穩(wěn)定酶分子的構(gòu)象,從而提高α-淀粉酶活性和穩(wěn)定性[28-29].

無Ca2+存在的情況下,重組酶rAmyWQJ在70 ℃保溫20 min,基本喪失活力. 但在添加5、 10、 15 mmol·L-1Ca2+的情況下,酶的熱穩(wěn)定性有很大的提高. 在70 ℃保溫60 min,分別殘留33.6%、 68.9%、 74.7%的酶活力(見圖8(a))； 在75 ℃下,添加10、 15 mmol·L-1Ca2+,保溫60 min,分別殘留47.6%和65.8%的酶活力(見圖8(b))； 在80 ℃下,添加10、 15 mmol·L-1Ca2+,保溫60 min,分別殘留34.7%和38.6%的酶活力,而添加5 mmol·L-1Ca2+,保溫60 min,僅剩約10%的酶活力(見圖8(c)). 由此說明Ca2+對該酶在70、 75、 80 ℃等較高溫度下的熱穩(wěn)定性影響很大,而10、 15 mmol·L-1Ca2+能顯著提高重組酶rAmyWQJ的熱穩(wěn)定性.

圖8 添加不同濃度Ca2+對重組酶rAmyWQJ熱穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of different concentration Ca2+on thermostability of recombinant rAmyWQJ

2.5.4 金屬離子和化學(xué)試劑對淀粉酶活力的影響

α-淀粉酶是金屬酶,很多金屬離子(特別是重金屬離子)及金屬螯合劑對其有抑制作用. 表3顯示18種兩個不同濃度(終濃度1和5 mmol·L-1)的金屬離子及化學(xué)試劑對重組酶rAmyWQJ活力的影響. 其中在1 mmol·L-1濃度下,Hg2+完全抑制了重組酶rAmyWQJ的活力； 在5 mmol·L-1濃度下,EDTA和SDS分別抑制酶活力的26.7%和25.8%,Cr3+、 Mn2+、 Cu2+和Pb2+對該酶有輕微的抑制作用,分別抑制酶活力的10.0%、 11.8%、 19.1%和13.9%； Co2+、 Na+、 Ca2+和β-Mercaptoethanol對該酶有促進(jìn)作用,其中5 mmol·L-1的β-Mercaptoethanol對酶的促進(jìn)作用最大,酶活力提高15.4%.

表3 不同金屬離子及相關(guān)化學(xué)試劑對重組酶rAmyWQJ活力的影響Tab.3 Effects of different metal ions and chemicals on recombinant rAmyWQJ activity (%)

2.5.5α-淀粉酶動力學(xué)參數(shù)的測定

以不同濃度的可溶性淀粉為底物測定α-淀粉酶活力,利用Linewaeaver-Burk作圖法,以底物質(zhì)量濃度ρ的倒數(shù)1/ρ為橫坐標(biāo)、 反應(yīng)速率v的倒數(shù)1/v為縱坐標(biāo)作圖,結(jié)果如圖9所示. 經(jīng)計算Km=6.62 mg·mL-1,vmax=2 197.80 μmol·(mg·min)-1.

2.5.6 重組酶rAmyWQJ的底物特異性

表4為重組酶rAmyWQJ的底物特異性,由表4可知,重組酶rAmyWQJ的最適作用底物是木薯淀粉,其次是可溶性淀粉、 玉米淀粉和馬鈴薯淀粉,而該酶對糊精(玉米)的降解效率僅為對可溶性淀粉降解效率的33.0%,檢測不到該酶對β-環(huán)狀糊精和普魯蘭多糖有降解作用.

2.5.7α-淀粉酶水解產(chǎn)物的分析

采用硅膠板薄層色譜分析重組酶rAmyWQJ水解木薯淀粉的終產(chǎn)物,結(jié)果如圖10所示. 由圖10可知,木薯淀粉在該酶作用下,最終主要轉(zhuǎn)化生成麥芽六糖和麥芽七糖,還有其他不同聚合度的糊精,表明該酶為內(nèi)切酶,能切開淀粉分子內(nèi)部α-1,4-糖苷鍵,將木薯淀粉降解成水溶性的糊精和低聚糖.

圖9 重組酶rAmyWQJ的Lineweaver-Burk圖Fig.9 Lineweaver-Burk plot of recombinant rAmyWQJ

圖10 重組酶rAmyWQJ的水解產(chǎn)物分析(TLC法)Fig.10 Final hydrolysates analysis of recombinant rAmyWQJ表4 重組酶rAmyWQJ的底物特異性Tab.4 Substrate affinity of recombinant rAmyWQJ

(%)

3 結(jié)語

本研究克隆了Geobacillussp.WQJ-1的α-淀粉酶基因,并在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá),酶活力為173.0 U·mL-1,相對分子質(zhì)量大小約為59 ku. 酶學(xué)性質(zhì)研究表明,該重組酶最適反應(yīng)pH值和溫度分別為6.0和70 ℃,在pH5.0～10.0的范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性,屬于中溫、 中性α-淀粉酶. Ca2+能顯著提高重組酶在70、 75、 80 ℃等較高溫度下的熱穩(wěn)定性,添加10、 15 mmol·L-1Ca2+在80 ℃下保溫60 min,仍能保留35%左右的酶活力. Hg2+、 EDTA 和SDS對該酶有顯著的抑制作用,Co2+、 Na+和β-Mercaptoethanol對該酶有促進(jìn)作用,在工業(yè)應(yīng)用中添加Co2+、 Na+和β-Mercaptoethanol可簡化生產(chǎn)工藝,降低生產(chǎn)成本. 以可溶性淀粉作為底物,經(jīng)計算得該酶的動力學(xué)參數(shù)Km為6.62 mg·mL-1,vmax為2 197.80 μmol·(mg·min)-1. 酶的底物特異性實驗結(jié)果顯示其最適作用底物是木薯淀粉,其次是可溶性淀粉、 玉米淀粉和馬鈴薯淀粉. 經(jīng)薄層層析分析,該酶水解木薯淀粉主要生成麥芽六糖和麥芽七糖,還有其他不同聚合度的糊精,表明該酶為內(nèi)切酶.

由于該酶屬于中溫、 中性的內(nèi)切α-淀粉酶,且具有較強(qiáng)的pH穩(wěn)定性,因此在食品行業(yè)中面包的制作及其他食品的前處理、 飼料添加劑中動物生產(chǎn)性能的提高、 絲綢、 人造棉、 化學(xué)纖維等行業(yè)具有良好的開發(fā)應(yīng)用價值.

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