， ， ， 天霞， ，

(山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 山東 濟(jì)南 250014)

迷走神經(jīng)末梢釋放的乙酰膽堿(Ach)[1]與巨噬細(xì)胞煙堿型乙酰膽堿受體nAchRα7特異性結(jié)合，通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制腫瘤壞死因子TNF-α和白細(xì)胞介素4(IL-4)的合成、釋放[2]，并且這些特點(diǎn)在機(jī)體的炎癥反應(yīng)中還可以一起協(xié)作，發(fā)揮一定功效，減少炎癥反應(yīng)發(fā)生。研究[3-5]證明，內(nèi)毒素(LPS)炎癥大鼠的迷走傳出神經(jīng)纖維放電頻率增加，腦干迷走復(fù)合體(DVC)中的即刻早期基因(Fos)蛋白表達(dá)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且膽堿能抗炎癥通路中有DVC的參與。星形膠質(zhì)細(xì)胞參與構(gòu)成了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基本骨架，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞顯示出很多功能，當(dāng)機(jī)體受到生理和病理方面的刺激時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞可以迅速作出反應(yīng)。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞的一種獨(dú)立纖維結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。疑核(NA)與迷走神經(jīng)背核(DMV)以及孤束核(NTS)作為副交感神經(jīng)的初級中樞，在功能、結(jié)構(gòu)上存在緊密聯(lián)系，而且NA還與DMV構(gòu)成副交感神經(jīng)系統(tǒng)節(jié)前神經(jīng)元，它發(fā)出的神經(jīng)纖維組成了迷走傳出神經(jīng)纖維，由此可推測出NA參與炎癥反應(yīng)通路。已有研究證明，免疫調(diào)節(jié)存在單側(cè)優(yōu)勢，大腦的左、右半球在各方面也存在不均衡性。左、右兩側(cè)的NA在參與炎癥反應(yīng)時(shí)是否也存在左側(cè)優(yōu)于右側(cè)或者右側(cè)優(yōu)于左側(cè)的一側(cè)優(yōu)勢，目前鮮有相關(guān)文獻(xiàn)研究。本文中通過設(shè)計(jì)注射LPS致炎癥大鼠的實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)、酶聯(lián)免疫等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，觀察NA中Fos和GFAP的表達(dá)以及一些炎癥細(xì)胞因子水平的變化，研究NA是否參與炎癥反應(yīng)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Wistar大鼠由山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購買，體質(zhì)量為(300±20) g；一抗兔抗c-Fos購于圣克魯斯生物技術(shù)(上海)公司；一抗兔抗GFAP購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SP系列試劑盒、正常山羊血清購于北京中杉金橋公司；LPS購于美國Sigma公司。

1.2 動(dòng)物分組

將大鼠隨機(jī)分為LPS組和生理鹽水對照組，其中LPS組按照劑量5 mg/kg(每千克大鼠體質(zhì)量注射5 mg藥物)注射LPS,每組6只，生理鹽水對照組腹腔注射等量的生理鹽水，每組6只。

將大鼠分成以下4組：假損毀左側(cè)NA并注射LPS組，6只；損毀左側(cè)NA并注射LPS組，6只；假損毀右側(cè)NA并注射LPS組，6只；損毀右側(cè)NA并注射LPS組，6只。

1.3 NA的定位與損毀

大鼠于實(shí)驗(yàn)前可以正常飲水、進(jìn)食。對大鼠腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉處理，前囟沿正中線向后-12.60 mm、深度9.58 mm、雙側(cè)旁開2.1 mm進(jìn)行NA定位，將損毀電極插入NA中，確保損毀電流的負(fù)極與大鼠的皮膚相連，正極在電極上，接通電損毀。手術(shù)后再飼養(yǎng)3 d，以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。大鼠經(jīng)乙醚輕度麻醉后，腹腔注射LPS。

1.4 TNF-α及IL-4檢測

血樣采集步驟如下：從股動(dòng)脈取1 mL血樣置于離心管中，用離心機(jī)在溫度為4 ℃時(shí)離心分離10～15 min，然后將血清放入溫度為-20 ℃的冰箱儲(chǔ)存，備用。

使用ELISA試劑盒檢測樣本， 根據(jù)TNF-α和IL-4的檢測范圍， 使用酶標(biāo)儀測試試樣以及標(biāo)準(zhǔn)樣品的光密度，根據(jù)數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出待測血樣中TNF-α和IL-4的濃度。

1.5 組織準(zhǔn)備

灌流、固定、取腦步驟如下：左心室插針達(dá)主動(dòng)脈，用200～300 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)通過大鼠主動(dòng)脈將腦組織血液沖洗干凈。用250～300 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛(PFA)溶液進(jìn)行灌流、固定，然后將腦剖出，并放入盛有多聚甲醛的瓶中，在溫度為4 ℃的冰箱再固定6 h，然后放入配好的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的蔗糖溶液中脫水，過夜。在腦沉底后用冰凍切片機(jī)進(jìn)行切片，先粗切修片，再細(xì)切留片。將切好的腦片放在PBS中備用。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

將切好的腦切片用PBS漂洗3次，每次5 min以沖掉包埋劑。然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的過氧化氫與甲醇混合溶液，室溫孵育30 min以消除內(nèi)源性酶的活性；再加入封閉液，室溫孵育1 h；最后加入兔抗GFAP抗體(用封閉液稀釋，稀釋度為1∶500)或兔抗Fos抗體(用封閉液稀釋，稀釋度為1∶500)，在溫度為4 ℃時(shí)孵育過夜；次日拿出復(fù)溫30 min，磷酸鹽吐溫緩沖溶液(PBST)沖洗3次，每次15 min，然后依次加入生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫下各孵育2 h；用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液進(jìn)行避光顯色3～5 min；顯色結(jié)束后，用PBS終止顯色漂洗，最后將腦片貼在載玻片上，脫水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為75%、95%、100%的酒精)，透明(二甲苯Ⅰ、Ⅱ)，中性樹膠封片。

1.7 顯微鏡拍照計(jì)數(shù)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用顯微鏡觀察腦干DMV和NTS中GFAP或者Fos在免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中神經(jīng)元表達(dá)情況；找出所觀察部位，拍照。所有神經(jīng)元每0.01 mm2的個(gè)數(shù)均用Image Pro-Plus 6.0 圖象分析軟件統(tǒng)計(jì)處理，采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用雙尾獨(dú)立性樣本t-檢驗(yàn)比較組間均數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠血清中TNF-α和IL-4在LPS炎癥中的表達(dá)

表1所示為大鼠血清中TNF-α和IL-4在LPS

炎癥中的表達(dá)水平。由表可知，與對照組相比，LPS炎癥時(shí)大鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α水平顯著升高(顯著性檢驗(yàn)水平P<0.05)， IL-4含量增大(P<0.01)。

表1 大鼠血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素4(IL-4)在內(nèi)霉素(LPS)炎癥中的表達(dá)水平

2.2 LPS炎癥對大鼠NA的Fos陽性神經(jīng)元和GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的影響

與對照組相比， NA中Fos陽性神經(jīng)元個(gè)數(shù)顯著增加(P<0.05)，GFAP的表達(dá)量增加極顯著(P<0.01)，見圖1、表2。由此推斷，在LPS炎癥大鼠模型中，除了神經(jīng)元參與炎癥反應(yīng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞也參與了炎癥反應(yīng)。

2.3 LPS炎癥大鼠在電損毀左側(cè)NA后血清中TNF-α和IL-4的表達(dá)

表3所示為LPS炎癥大鼠在損毀左側(cè)NA后血清TNF-α和IL-4水平的變化。由表可知，損毀左側(cè)NA與假損毀相比，大鼠血清中抗炎因子IL-4在LPS炎癥中的水平極顯著增大(P<0.01)，而在促炎因子TNF-α中的水平極顯著減小(P<0.01)。由此推測，在正常情況下，左側(cè)NA可能對抗炎因子IL-4具有一定的抑制作用，而對于促炎因子起促進(jìn)作用。

(a)生理鹽水組NA的GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá),放大200倍(b)LPS組NA的GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá),放大200倍(c)生理鹽水組NA的Fos陽性神經(jīng)元表達(dá),放大100倍(d)LPS組NA的Fos陽性神經(jīng)元表達(dá),放大100倍圖1 內(nèi)霉素(LPS)炎癥時(shí)疑核(NA)中即刻早期基因(Fos)與膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)

表2 大鼠穎核(NA)在內(nèi)霉素(LPS)炎癥中即刻早期基因(Fos)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)

表3 內(nèi)霉素(LPS)炎癥大鼠在損毀左側(cè)疑核(NA)后血清腦瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素4(IL-4)水平的變化

2.4 電損毀左側(cè)NA對LPS炎癥大鼠腦干Fos陽性神經(jīng)元和GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的影響

與假損毀左側(cè)NA相比， 損毀左側(cè)NA后， LPS炎癥大鼠腦干中的NTS中GFAP 的表達(dá)雖有所增加，然而無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明左側(cè)NA對星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性沒有較大影響；而Fos陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著增多，陽性神經(jīng)元的表達(dá)情況具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明左側(cè)NA對NTS中神經(jīng)元的激活具有一定的相關(guān)性，甚至能夠抑制NTS中某些神經(jīng)元的表達(dá)；DMV中GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞和Fos陽性神經(jīng)元的數(shù)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4、5和圖2。

表4 內(nèi)霉素(LPS)炎癥大鼠在損毀左側(cè)疑核(NA)后腦干孤束核(NTS)中即刻早期基因(Fos)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)

表5 損毀左側(cè)疑核(NA)對內(nèi)霉素(LPS)炎癥大鼠腦干迷走神經(jīng)背核(DMV)中即刻早期基因(Fos)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)的影響

2.5 電損毀右側(cè)NA對LPS炎癥大鼠血清IL-4和TNF-α水平的影響

表6所示為LPS炎癥大鼠在損毀右側(cè)NA后血清TNF-α和IL-4水平的變化。由表可知，損毀右側(cè)NA并注射LPS組與假損毀右側(cè)NA并注射LPS組相比較，IL-4的水平是極顯著增大的(P<0.01)，而血清中TNF-α水平?jīng)]有顯著性差別(P>0.05)，這與損毀左側(cè)的結(jié)果有所不同，因此左、右兩側(cè)NA在炎癥中的作用可能存在著一定的差異。

2.6 LPS炎癥大鼠在電損毀右側(cè)NA后腦干GFAP和Fos的表達(dá)情況

通過注射LPS觀察，比較損毀右側(cè)NA與假損毀右側(cè)NA，發(fā)現(xiàn)大鼠NTS和DMV中GFAP和Fos的表達(dá)均無明顯的變化，見表7、8和圖3。由此推測，右側(cè)NA對DVC中的神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞無較大的影響。

3 討論

NA是位于腹外延髓的迷走神經(jīng)核，屬于下橄欖核與三叉神經(jīng)脊束核之間的特殊軀體運(yùn)動(dòng)核和內(nèi)臟神經(jīng)核。本課題組的前期研究表明，由LPS所致炎癥大鼠腦干DVC發(fā)出的迷走傳出神經(jīng)纖維放電頻率增加，興奮性增強(qiáng)。同時(shí)，LPS大鼠腦干中Fos蛋白表達(dá)量顯著增多，證明了DVC參與膽堿能抗炎癥通路。延髓內(nèi)臟帶核團(tuán)包括NTS、DMV和NA，NA與DVC不僅在結(jié)構(gòu)和功能上具有密切聯(lián)系，并且還與DMV構(gòu)成了副交感神經(jīng)系統(tǒng)的節(jié)前神經(jīng)元[6-7]，由DMV發(fā)出的神經(jīng)纖維構(gòu)成了迷走傳出神經(jīng)纖維，因此推出NA參與了炎癥反應(yīng)。

LPS不僅可以促使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，還能介導(dǎo)炎癥的發(fā)生。謝國旗等[8]的研究表明，在LPS誘導(dǎo)的小鼠肝損傷中，白介素-6和腫瘤壞死因子的含量明顯增大，且與LPS呈顯著的量效關(guān)系。張青等[9]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肺組織經(jīng)過不同劑量的LPS致傷后， 劑量加強(qiáng)的促炎因子和抗炎因子的信使核糖核酸(mRNA)表達(dá)均增多。 本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 大鼠腹腔注射LPS 3 h后血清中IL-4及TNF-α的含量也都增大， 且與對照實(shí)驗(yàn)比較，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與文獻(xiàn)[8]中的研究內(nèi)容結(jié)論基本一致。C-Fos是一個(gè)傷害性基因以及Fos，當(dāng)機(jī)體受到外周的各種物理化學(xué)性刺激時(shí)，它可以在其細(xì)胞內(nèi)迅速表達(dá)，在感覺神經(jīng)傳導(dǎo)的神經(jīng)通路上，多數(shù)神經(jīng)元均會(huì)出現(xiàn)Fos蛋白的表達(dá)，一般與受刺激的程度成正比[10-11]。研究[12]證實(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞在維持正常生理活動(dòng)、神經(jīng)免疫以及神經(jīng)組織修復(fù)與再生中均發(fā)揮著重要的作用。GFAP是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞的一種獨(dú)立纖維結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)[13-14]，因此本文中用 GFAP來檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)腹腔注射LPS以后，與對照組對比， NA與DMV中GFAP和Fos的表達(dá)均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 由此推測，在構(gòu)建的LPS炎癥大鼠實(shí)驗(yàn)中，不僅有NA 和DMV 中的神經(jīng)元參與炎癥反應(yīng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞也共同參與了反應(yīng)。

(a)假損毀左側(cè)NA并注射LPS組NTS與DMV中Fos陽性神經(jīng)元的表達(dá),放大100倍(b)損毀左側(cè)NA并注射LPS組NTS與DMV中Fos陽性神經(jīng)元的表達(dá),放大100倍(c)假損毀左側(cè)NA并注射LPS組NTS與DMV中GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá),放大100倍(d)損毀左側(cè)NA并注射LPS組NTS與DMV中GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá),放大100倍圖2 假損毀左側(cè)疑核(NA)并注射內(nèi)霉素(LPS)與損毀左側(cè)NA并注射LPS組中大鼠孤束核(NTS)和迷走神經(jīng)背核(DMV)即刻早期基因(Fos)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)

表6 內(nèi)霉素(LPS)炎癥大鼠在損毀右側(cè)疑核(NA)后血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素4(IL-4)水平的變化

表7 損毀右側(cè)疑核(NA)對內(nèi)霉素(LPS)炎癥大鼠腦干孤束核(NTS)中即刻早期基因(Fos)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)的影響

表8 損毀右側(cè)疑核(NA)對內(nèi)霉素(LPS)炎癥大鼠腦干迷走神經(jīng)背核(DMV)中即刻早期基因(Fos)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)的影響

(a)假損毀右側(cè)NA并注射LPS組NTS與DMV中Fos陽性神經(jīng)元的表達(dá),放大100倍(b)損毀右側(cè)NA并注射LPS組NTS與DMV中Fos陽性神經(jīng)元的表達(dá),放大100倍(c)假損毀右側(cè)NA并注射LPS組NTS與DMV中GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá),放大100倍(d)損毀右側(cè)NA并注射LPS組NTS與DMV中GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá),放大100倍圖3 假損毀右側(cè)疑核(NA)并注射內(nèi)霉素(LPS)組與損毀右側(cè)NA并注射LPS組大鼠孤束核(NTS)和迷走神經(jīng)背核(DMV)中即刻早期基因(Fos)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)

大腦左、 右半球在結(jié)構(gòu)、 功能、 認(rèn)知活動(dòng)等方面均具有功能不對稱性[15]。 許多證據(jù)表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)可以對細(xì)胞因子的產(chǎn)生進(jìn)行調(diào)控。 實(shí)驗(yàn)[16]發(fā)現(xiàn)， 切除左側(cè)皮質(zhì)后, LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素1(IL-1)的含量減少, 與切除右側(cè)皮層的結(jié)果相反。 已有實(shí)驗(yàn)證明,腦的不對稱性會(huì)影響下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸, 在行為不對稱中， 研究上通常將習(xí)慣用左手的稱為左利者， 習(xí)慣用右手的稱右利者。 有實(shí)驗(yàn)表明， 大鼠腹腔注射LPS模擬炎癥疾病, 左利者、 右利者的大鼠某些激素有所增加， 且增加的程度與大腦的左、右不對稱性有關(guān)， 例如， 皮質(zhì)酮和血漿促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)[17]。 從解剖學(xué)角度來觀察大腦的海馬等核團(tuán)與下丘腦存在一定的聯(lián)系， HPA軸會(huì)因這種聯(lián)系而被刺激。 由于海馬區(qū)可以調(diào)節(jié)該軸的興奮性,因此有實(shí)驗(yàn)對海馬中類固醇激素受體的分布進(jìn)行了研究, 發(fā)現(xiàn)右側(cè)海馬區(qū)表達(dá)更高的鹽皮質(zhì)激素受體與左利鼠密切相關(guān)[18]。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)損毀左側(cè)NA后， 其LPS炎癥大鼠血清中IL-4水平是極顯著增大的， 而TNF-α水平是極明顯減小的， 其中， 左側(cè)損毀組IL-4的質(zhì)量濃度((70.05±10.98)ng·L-1)約是假損毀左側(cè)組IL-4質(zhì)量濃度((23.11±4.76)ng·L-1)的3倍， 假損毀左側(cè)組TNF-α的質(zhì)量濃度((131.22±12.44) ng·L-1)約是損毀左側(cè)組TNF-α質(zhì)量濃度)(70.05±8.01) ng·L-1)的1.9倍，可見左側(cè)NA可能對IL-4和TNF-α分別具有不同的作用，一個(gè)是抑制，一個(gè)是促進(jìn)。LPS炎癥大鼠損毀右側(cè)NA與假損毀右側(cè)NA相比，TNF-α的水平?jīng)]有顯著變化，其中假損毀右側(cè)組TNF-α的質(zhì)量濃度為(89.98±9.89)ng·L-1，損毀右側(cè)組TNF- α的質(zhì)量濃度為(88.98±8.89) ng·L-1， 可見這與左側(cè)變化水平不一致，但是IL-4的水平變化，損毀右側(cè)與假損毀右側(cè)組相比是極顯著增大的，其中損毀右側(cè)組IL-4的質(zhì)量濃度((49.98±6.01)ng·L-1)約是假損毀左側(cè)組IL-4質(zhì)量濃度((23.08±2.98)ng·L-1)的2倍， 這與損毀左側(cè)的結(jié)果是相同的。由此可知，左側(cè)NA與右側(cè)NA 在炎癥反應(yīng)中的作用可能存在一定的區(qū)別。NA與DVC不僅在結(jié)構(gòu)和功能上具有密切聯(lián)系，并且還與DMV構(gòu)成了副交感神經(jīng)系統(tǒng)的節(jié)前神經(jīng)元。關(guān)于在炎癥反應(yīng)中，NA與DVC是否存在相互作用的問題，本實(shí)驗(yàn)在損毀左側(cè)NA后發(fā)現(xiàn)， DVC、 NTS中GFAP的表達(dá)沒有顯著性差異(P>0.05)， 但是Fos蛋白的表達(dá)增加。 損毀右側(cè)NA后， 大鼠腦干DVC包括NTS、 DMV中的GFAP和Fos的表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 由此推測， 在炎癥反應(yīng)過程中， 左側(cè)NA可能對NTS中神經(jīng)元的激活起抑制作用， 而右側(cè)NA對DVC中的神經(jīng)元以及星形膠質(zhì)細(xì)胞無影響。

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