盧 超，趙壽經,，張曉佳，杜芃川，王雪松,

(1.吉林大學 生物與農業(yè)工程學院，長春 130022；2.吉林大學 生命科學學院，長春 130012)

0 引 言

人參和西洋參是重要的傳統(tǒng)中藥材，人參皂苷是人參屬植物主要的藥理活性成分[1,2]。與西洋參相比，人參根部的Rg1/Rd比值較高，這是傳統(tǒng)中醫(yī)理論人參“性溫”而西洋參“性涼”的現(xiàn)代分子基礎[3,4]。原人參二醇型皂苷以人參皂苷Rd為代表，主要通過催化原人參二醇的C3和C20號位羥基的糖基化形成；原人參三醇型皂苷以人參皂苷Rg1為代表，主要通過催化原人參三醇的C6和C20號位羥基的糖基化形成[5,6]。

原人參二醇3號位葡糖糖基轉移酶1基因(Pg3-O-UGT1)可催化原人參二醇形成人參皂苷Rh2，是二醇型皂苷合成過程的關鍵酶基因。通過RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術抑制人參中Pg3-O-UGT1基因的表達，可使代謝能量主要流向三醇型皂苷合成支路；在改善人參藥理活性的同時為人參皂苷合成途徑的分子機理研究奠定基礎[7,8]。

本文利用酶切連接技術，通過克隆載體構建了人參3-O-UGT1基因的植物表達載體工程菌(A4-pBI121-3UGT1-RNAi)，為研究人參皂苷體內合成機制和種質創(chuàng)新奠定了基礎，也為傳統(tǒng)名貴中藥材的研究提供了素材。

1 實驗材料

人參發(fā)根材料和發(fā)根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)A4為本實驗室保存;感受態(tài)大腸桿菌JM109、pMD20-T載體、pBI121植物雙元表達載體、總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶以及各種限制性內切酶等，均購于寶生物工程(大連)有限公司；卡那霉素購自于北京鼎國生物制品有限公司。

2 試驗方法

2.1 RNA干擾元件核心片段的獲得

由GenBank得到原人參二醇3號位葡糖糖基轉移酶1基因(Pg3-O-UGT1；JX898529)序列，通過Clustal X軟件將其核酸序列與其他物種糖基轉移酶基因(西洋參GT, KR028477; 黃瓜GT, XM004136988; 甜瓜GT, XM008457048)對比確定其保守區(qū)域。再與人參中原人參二醇合成酶基因(人參D12H, JN604536)、原人參三醇合成酶基因(人參P6H, JX036031)、人參皂苷3號位葡糖糖基轉移酶2基因(人參GT2, JX898530)對比確定干擾區(qū)域不會影響其他相關基因的正常表達。用軟件 Primer Premier 5.0設計核心片段的特異性引物：P1, 5′- AGA GGA AAA AGG CCT AAT AGT GAG T-3′；P2, 5′-ACT CAT CAA TAT TCT TAT CAG AGC T-3′。

以MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周的人參發(fā)根為實驗材料，用植物總RNA提取試劑盒提取人參總RNA。以總RNA為模板，用反轉錄試劑盒進行RT-PCR，獲得人參cDNA。以人參cDNA為模板進行核心片段的PCR擴增，將純化后的PCR產物按比例與pMD20-T載體進行TA克隆連接，采用熱轉化法將連接產物轉化至E.coliJM109感受態(tài)細胞中，提取質粒測序驗證。將驗證正確的重組質粒命名為pMD-GT。

2.2 RNA干擾元件的構建

以重組質粒pMD-GT為模板，以P3(在P1的5′端添加XbaⅠ酶切位點和保護堿基)和P4(在P2的5′端添加BamH Ⅰ酶切位點和保護堿基)為引物擴增正義片段，PCR程序與擴增核心片段相同；以重組質粒pMD-GT為模板，以P5(在P2的5′端添加SmaⅠ酶切位點和保護堿基)和P6(在P1的5’端添加SacⅠ酶切位點和保護堿基)為模板擴增反義片段，PCR程序與上相同。使用XbaⅠ/BamH Ⅰ限制酶對重組質粒pMD-GT和正義片段同時雙酶切，純化酶切產物，使用T4 DNA連接酶進行連接，將測序驗證后的重組載體命名為pMD-S；使用SmaⅠ/SacⅠ限制酶對重組質粒pMD-S和反義片段同時雙酶切，純化酶切產物，使用T4 DNA連接酶進行連接，采用熱轉化法將連接產物轉化至E.coliJM109感受態(tài)細胞中，提取質粒進行雙酶切和測序驗證。將驗證后的重組載體命名為pMD-3UGT1-RNAi(3種重組質粒結構如圖1所示)。

圖1 三種重組載體結構示意圖Fig. 1 Schematic diagram of three recombinant vectors

2.3 RNA干擾表達載體的構建和轉化

使用XbaⅠ/SacⅠ限制酶對重組質粒pMD-3UGT1-RNAi和表達載體pBI121同時雙酶切，純化酶切產物，使用T4 DNA連接酶進行連接，采用熱轉化法將連接產物轉化至E.coliJM109感受態(tài)細胞中，涂布于含有50 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)挑取單菌落擴大培養(yǎng)后提取質粒進行雙酶切驗證。將驗證后的重組載體命名為pBI121-3UGT1-RNAi。采用熱轉化法將重組載體pBI121-3UGT1-RNAi轉化至發(fā)根農桿菌A4感受態(tài)細胞中，涂布于含有50 mg/L卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h，挑取單菌落擴大培養(yǎng)后提取Ri質粒進行質粒PCR驗證。

3 結果與分析

3.1 RNA干擾元件核心片段的擴增

相關基因的核酸序列對比結果如圖2和3所示。在所示圖中，序列上方的黑點越密集就表示該區(qū)域保守性越高，反之亦然。

圖2 不同植物GT基因序列對比圖Fig. 2 Comparison of GT sequences in different plants

圖3 人參中相關基因序列對比圖Fig. 3 Comparison of relative gene sequences inPanax ginseng

在圖2中，所選取的Pg3-O-UGT1基因片段與西洋參、甜瓜、黃瓜的糖基轉移酶(GT)基因相比較具有較高的保守性，可以確定該核酸片段為Pg3-O-UGT1基因核心片段。在圖3中，擬干擾的核心片段與人參中其他影響皂苷合成的基因相似性很低。因此，干擾所選取的目的基因不會影響其他與皂苷合成的相關基因的正常表達。

人參發(fā)根總RNA的電泳結果如圖4所示。在圖4的 1～3泳道中28S rRNA和18S rRNA的特征條帶清晰，且28S rRNA和18S rRNA條帶的亮度和寬度比例大約為2∶1。電泳結果證明所提總RNA比較完整，滿足后續(xù)實驗需要。

圖4 人參總RNA電泳圖Fig.4 Electrophoresis of total RNA from Panax ginseng

以人參發(fā)根總RNA發(fā)轉錄獲得的cDNA為模板，以P1/P2為引物擴增核心片段。核心片段的電泳結果如圖5所示。

圖5 RT-PCR產物電泳圖Fig. 5 Electrophoresis of the RT-PCR products

在圖5中，1-4泳道在380bp左右處有清晰條帶，將該條帶純化回收后與pMD20-T載體連接，并轉化E.coliJM109感受態(tài)細胞。將陽性克隆菌送至北京金維智公司進行測序驗證，測序結果與GenBank已發(fā)表的糖基轉移酶序列一致。將經驗證的該重組質粒命名為pMD-GT。

3.2 RNA干擾元件的構建

以重組質粒pMD-GT為模板，以P3/P4為引物擴增正義片段。用XbaⅠ/BamHⅠ限制酶對純化后的正義片段與重組質粒pMD-GT同時雙酶切，用T4 DNA連接酶進行連接并轉化E.coliJM109感受態(tài)細胞。提取陽性克隆菌質粒進行雙酶切和測序驗證，雙酶切結果如圖6所示。

在圖6中，1泳道2730bp和380bp大小條帶分別是經酶切后的pMD20-T載體片段和正義片段。將驗證后的重組載體命名為pMD-S。

以重組質粒pMD-GT為模板，以P5/P6為引物擴增反義片段。用SmaⅠ/SacⅠ限制酶對純化后的反義片段與重組質粒pMD-S同時雙酶切，用T4 DNA連接酶進行連接并轉化E.coliJM109感受態(tài)細胞。提取陽性克隆菌質粒用XbaⅠ/SacⅠ限制酶進行雙酶切和測序驗證，雙酶切結果如圖7所示。

圖6 pMD-S克隆載體的雙酶切鑒定Fig.6 Double enzyme digestion of pMD-S vector

圖7 pMD-3UGT1-RNAi克隆載體的雙酶切鑒定Fig. 7 Double enzyme digestion ofpMD-3UGT1-RNAi vector

在圖7中，1泳道2730bp和780bp大小條帶分別是經酶切后的pMD20-T載體片段和構建好的RNAi干擾元件。將驗證后的重組載體命名為pMD-3UGT1-RNAi。

3.3 RNA表達載體的構建和轉化

使用XbaⅠ/SacⅠ限制酶對重組質粒pMD-3UGT1-RNAi和表達載體pBI121同時雙酶切，用T4 DNA連接酶進行連接并轉化E.coliJM109感受態(tài)細胞。提取陽性克隆菌質粒進行雙酶切驗證，雙酶切結果如圖8所示。

在圖8中，1泳道13600bp和780bp大小條帶分別是經酶切后的pBI121載體片段和構建好的RNAi干擾元件。電泳結果與預期一致，說明表達載體pBI121-3UGT1-RNAi構建成功。

圖8 pBI121-3UGT-RNAi表達載體的雙酶切鑒定Fig.8 Double enzyme digestion of expressionvector pBI121-3UGT1-RNAi

用熱轉化法[9]將重組載體pBI121-3UGT1-RNAi轉化至發(fā)根農桿菌A4感受態(tài)細胞中，涂布于含有50 mg/L卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h后，挑取陽性克隆菌擴大培養(yǎng)。提取陽性克隆菌的Ri質粒進行質粒PCR鑒定，以Ri質粒為模板，P1/P2為引物。電泳結果如圖9所示。

圖9 質粒PCR電泳圖Fig.9 Electrophoresis of the plasmid PCR products

在圖9中，兩泳道在380bp左右處有清晰條帶，表明RNAi植物表達載體成功轉入發(fā)根農桿菌A4中。將該工程菌命名為A4-pBI121-3UGT1-RNAi，甘油冷凍保存。

4 結束語

RNAi技術在鑒定功能基因和次級代謝產物合成的研究方面一直有著廣泛的應用。本文利用酶切連接技術，通過pMD20-T載體的高效利用，成功構建原人參二醇3號位葡糖糖基轉移酶1基因(Pg3-O-UGT1)RNAi植物表達載體，并構建了相應的植物表達載體工程菌A4-pBI121-3UGT1-RNAi。與一般構建方法相比，既避免了PCR條件的反復摸索，又能夠保證驗證的準確性，材料廉價易得，適應性廣。

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