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(安徽科技學(xué)院,安徽 鳳陽 233100)

老鴉瓣(Tulipaedulis)為百合科郁金香屬藥用植物[1]，別名迎春草、光慈姑，是早春開放的一種野花，屬多年生草本植物。老鴉瓣除去絨毛后的干燥鱗莖為光慈姑[2]。光慈姑味甘、性寒；具有抑菌、解毒散結(jié)、行血化癡之功效；主治咽喉腫痛、痛病、痛癥、瘡腫、產(chǎn)后癡滯[3]。老鴉瓣富含淀粉、生物堿[4]、黃酮類[5]等物質(zhì)。生物類黃酮是在植物中分布廣泛的一類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成分[6]。一些生物類黃酮具有良好的抗氧化活性[7]，目前老鴉瓣的研究主要集中在本草考證[8]、生理生物學(xué)特性[9]以及栽培繁育[10]等方面，但對老鴉瓣黃酮[11-12]抗氧化性的研究鮮有報道。目前,安徽蒙城地區(qū)有農(nóng)戶大量種植，在該地區(qū)老鴉瓣不僅作為一種中藥，同時還作為一種保健品和食材。

本試驗以乙醇為提取溶劑，采用恒溫水浴浸提法提取老鴉瓣黃酮，并通過正交試驗優(yōu)化提取工藝，同時對老鴉瓣黃酮的體外抗氧化活性進行探討，以期為老鴉瓣黃酮類化合物的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

老鴉瓣由安徽迎春草生物科技有限公司提供。NaNO2(AR，上海弘順生物科技有限公司)；Vc(AR，上海試四赫維化工有限公司)；Tris(AR，上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；Al(NO3)3、FeSO4(AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)(AR，美國Sigma公司)；鄰苯三酚(AR，上海振企化學(xué)試劑有限公司)；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號Lot.No.F20051117)。

1.2 試驗儀器與設(shè)備

AR2140電子天平(梅特勒-托利多(上海)有限公司)；Y-800G型中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；DT5-4型低速大容量多管離心機(北京時代北利離心機有限公司)；U-T6PC紫外可見分光光度計(屹譜儀器制造(上海)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 老鴉瓣提取工藝流程及其主要影響因素

(1)老鴉瓣提取工藝流程：老鴉瓣樣品→去雜→烘干→粉碎過篩→加入乙醇→溫水浴浸提→離心→濃縮→冷凍干燥→收集黃酮→計算提取率。

提取率(%) =[(X×D×V)/1 000W]×100%

其中：X為待測液的濃度，單位：mg/mL；D為稀釋倍數(shù)；V為提取液的體積，單位：mL；W為老鴉瓣質(zhì)量，單位：g。

(2)單因素試驗：分別研究了料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、提取時間(40、60、80、100、120 min)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(45%、55%、65%、75%、85%)對黃酮提取率的影響。

(3)正交試驗設(shè)計：根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以黃酮的提取率為綜合考察指標(biāo)，選定乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、提取時間(C)三因素三水平，進行正交試驗設(shè)計[13]。

在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計正交試驗，探究3個因素對黃酮提取率的綜合影響[14]。正交試驗水平與因素見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.2 黃酮鑒定及其含量的測定 準(zhǔn)確稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，60%的乙醇溶解定容至100 mL容量瓶中，得到0.1 mg/mL槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液[11]。用硝酸鋁法測定黃酮[12]。以槲皮素的含量為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為Y=1.072 9X+0.002 1，Y表示吸光度，R2=0.999 8。

1.3.3 老鴉瓣黃酮體外抗氧化試驗 采用鐵氰化鉀還原法[15]、DPPH法[16]、鄰二氮菲法[17]、鄰苯三酚自氧化法[18]分別對老鴉瓣黃酮的DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力的測定，測定3次，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 老鴉瓣黃酮提取的單因素試驗

2.1.1 料液比對老鴉瓣黃酮提取率的影響 由圖1可知，隨著料液比的增加，老鴉瓣黃酮的提取率先升高后趨于平緩，說明此時老鴉瓣黃酮已經(jīng)充分溶解，黃酮提取率不再發(fā)生變化，這與皇甫陽鑫提取銀杏葉黃酮考察料液比的結(jié)果一致[18]。

圖1 不同料液比對黃酮提取率的影響

2.1.2 提取時間對老鴉瓣黃酮提取率的影響 由圖2可知，隨著提取時間的增加，老鴉瓣黃酮的提取率先升高后下降，提取時間不足，老鴉瓣黃酮未能完全溶出，提取時間過長，引起老鴉瓣黃酮分解或損失，從而導(dǎo)致提取率降低。

圖2 不同提取時間對黃酮提取率的影響

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對老鴉瓣黃酮提取率的影響 由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，老鴉瓣黃酮的提取率先升高后下降，因為不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇改變了相應(yīng)的水溶液極性，老鴉瓣黃酮在乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時溶出性較好。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響

2.2 正交試驗結(jié)果

2.2.1 正交試驗結(jié)果 采用L9(34)正交表進行試驗，試驗每組平行測定3次，各取平均值，通過之前的線性回歸方程計算結(jié)果并進行分析。計算與分析結(jié)果見表2～3。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 正交試驗方差分析結(jié)果

由表2～3可知，極值R的大小顯示3種因素對老鴉瓣黃酮的提取率存在著不同的影響，其相應(yīng)的影響大小順序依次是A>C>B，在5%的相對水平上，乙醇的體積分?jǐn)?shù)和提取時間對老鴉瓣黃酮提取率的影響相對于料液比較為顯著，有數(shù)據(jù)結(jié)果可知，選擇A2、B1、C2這個組合作為老鴉瓣黃酮提取的最佳組合，提取率為3.46 %。

2.2.2 驗證試驗 根據(jù)正交試驗得到的結(jié)果，老鴉瓣黃酮提取的最佳組合是A2、B1、C2，按照此條件對該結(jié)果進行驗證試驗，此條件時的黃酮提取率平均為3.47%(表4)。

表4 驗證性實驗結(jié)果

2.3 老鴉瓣黃酮體外抗氧化能力

2.3.1 老鴉瓣黃酮對DPPH自由基清除能力 由圖4可知，老鴉瓣黃酮對DPPH自由基有一定的清除能力，在不同濃度時對DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，在濃度5 mg/mL時清除率可達63.57%。

圖4 DPPH自由基清除能力測定

2.3.2 老鴉瓣黃酮對羥基自由基清除能力 由圖5可知，老鴉瓣黃酮對羥基自由基有一定的清除能力。老鴉瓣黃酮在不同濃度時對羥基自由基清除能力呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，在濃度5 mg/mL時清除率可達53.97%。

圖5 羥基自由基清除能力測定

2.3.3 老鴉瓣黃酮對超氧陰離子自由基清除能力 由圖6可知，老鴉瓣黃酮對超氧陰離子自由基有一定的清除能力。老鴉瓣黃酮在不同濃度時對超氧陰離子自由基清除能力呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，在濃度5 mg/mL時清除率可達44.53%。

圖6 超氧陰離子自由基清除能力測定

3 結(jié)論與討論

老鴉瓣作為營養(yǎng)保健型中草藥正日益受到消費者關(guān)注，其研究與開發(fā)也在逐步深入。本試驗通過正交試驗優(yōu)化試驗設(shè)計結(jié)果得出老鴉瓣黃酮的最佳提取條件為：料液比1∶20(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取時間為80 min、提取溫度65 ℃，老鴉瓣黃酮提取率可達3.46 %。從試驗結(jié)果可知，老鴉瓣黃酮具有一定的抗氧化能力，且隨著黃酮濃度增大而增加，對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的最高清除率分別達到63.57%、53.97%、44.53%，為老鴉瓣的進一步開發(fā)利用提供實驗和參考依據(jù)。

在方差分析中可以看出料液比對老鴉瓣黃酮提取率的影響并無顯著性，提取時間對其影響較為顯著，而乙醇體積分?jǐn)?shù)對其影響最為顯著。乙醇是極性溶劑，黃酮化合物具有酚羥基，是一種常見的極性基團，根據(jù)相似相溶原理，老鴉瓣黃酮在乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%溶出性最好，乙醇體積分?jǐn)?shù)過高或過低，都會影響老鴉瓣黃酮的提取率。