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      4株芽孢桿菌的分離鑒定與生物學(xué)特性分析

      2018-03-12 02:55:43石水琴祁克宗宋祥軍
      江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年2期
      關(guān)鍵詞:沙門(mén)氏菌淀粉酶芽孢

      石水琴, 蔣 雯, 袁 林, 祁克宗, 涂 健, 宋祥軍

      (1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院,安徽合肥 230036; 2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,安徽合肥 230036; 3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,安徽合肥 230036)

      嗜熱微生物是一類(lèi)可以在45 ℃以上環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖的極端微生物,因其細(xì)胞和蛋白質(zhì)具有獨(dú)特的耐熱性,已引起廣泛關(guān)注,并且逐漸成為人們開(kāi)發(fā)利用的重要微生物資源。世界各國(guó)科學(xué)家不斷從各種自然高溫生態(tài)環(huán)境、地?zé)岘h(huán)境中篩選和分離出不同屬、種的嗜熱菌[1]。嗜熱菌在實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出顯著的作用效果和潛在的應(yīng)用前景。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的肥料、飼料及環(huán)境保護(hù)中常用的微生物活菌制劑包括多種微生物,其中芽孢桿菌是一類(lèi)需氧或兼性厭氧菌,菌體本身含有大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),隨著它們?cè)趧?dòng)物消化道內(nèi)的繁衍、代謝,可產(chǎn)生維生素、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)和未知生長(zhǎng)因子等,參與機(jī)體新陳代謝,同時(shí)還具有生物拮抗功能,可以減少動(dòng)物腸道有害菌的數(shù)量,維持消化道菌群平衡[2-5],在實(shí)際生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用。

      目前我國(guó)允許作為生態(tài)制劑的微生物有乳酸菌制劑、糞腸球菌制劑、芽孢桿菌制劑、酵母菌制劑和復(fù)合微生態(tài)制劑等。但通常使用的益生菌菌株的抗逆性較差,不耐熱,在飼料加工過(guò)程中損失較大,不能像芽孢桿菌可以直接加到配合飼料中,因此嗜熱芽孢桿菌作為益生菌的一種,具有其特有的生物特性。與其他微生物活菌制劑相比,芽孢桿菌具有在條件不利的環(huán)境下形成芽孢將自己保護(hù)起來(lái)的特點(diǎn),且復(fù)活率高。同時(shí)芽孢桿菌還具有耐酸、耐鹽、耐高溫及耐積壓等優(yōu)點(diǎn)[6-8],因此在飼料、肥料的生產(chǎn)中具有較高的穩(wěn)定性。目前在肥料、飼料工業(yè)及環(huán)保中應(yīng)用的主要有地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)等,在使用時(shí)多制成休眠狀態(tài)的活菌制劑或與乳酸菌混合使用[9],有益的芽孢桿菌能促進(jìn)機(jī)體免疫器官及組織的成熟,使這些器官、組織處于高度準(zhǔn)備狀態(tài),可促進(jìn)T-淋巴細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞數(shù)量增加,從而提高機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫水平,因此,芽孢桿菌在動(dòng)物和人體的微生態(tài)調(diào)節(jié)中也得到了高度的重視和廣泛的應(yīng)用。

      本研究以水產(chǎn)飼料為材料,采用常規(guī)細(xì)菌分離鑒定法結(jié)合分子生物學(xué)法從水產(chǎn)飼料中分離鑒定出4株嗜熱芽孢桿菌,并對(duì)菌株的耐高溫、耐酸、耐膽鹽及對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌抑菌性等一系列生物學(xué)特性進(jìn)行研究,為后續(xù)試驗(yàn)以及微生態(tài)飼料添加劑的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 試驗(yàn)材料

      試驗(yàn)材料為水產(chǎn)飼料蛋白粉,購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

      1.2 培養(yǎng)基

      1.2.1 搖瓶培養(yǎng)基 稱(chēng)取2.5 g LB培養(yǎng)基溶于100 mL蒸餾水中,121 ℃高壓滅菌15 min,4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

      1.2.2 產(chǎn)蛋白酶初篩選擇性培養(yǎng)基 干酪素8 g,磷酸氫二鈉(Na2HPO4)1 g,磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.36 g,瓊脂20 g,氯化鈉(NaCl)5 g,加入1 000 mL蒸餾水,加熱攪拌,pH值7.4±0.2,121 ℃高壓滅菌15 min,4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

      1.2.3 產(chǎn)淀粉酶初篩選擇性培養(yǎng)基 牛肉浸膏5 g,酪蛋白水解物17.5 g,淀粉1.5 g,瓊脂13.5 g,加入1 000 mL蒸餾水,加熱攪拌,pH值7.2±0.2,121 ℃高壓滅菌15 min,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.3 芽孢桿菌的分離、純化

      取2 g樣品溶解到20 mL無(wú)菌水中,振蕩溶解。取混合液接種到20 mL LB液體培養(yǎng)基中,于45 ℃振蕩(150 r/min)培養(yǎng)24~48 h,待培養(yǎng)基變得混濁后,取1 mL培養(yǎng)液按一定的稀釋度稀釋?zhuān)坎加贚B固體培養(yǎng)基上,置于50 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48 h,挑取單菌落,接于新鮮培養(yǎng)基上,重復(fù)多次直至菌落純化。選取生長(zhǎng)較好的A2、A3、A4、A5菌株進(jìn)行理化性質(zhì)的研究。

      1.4 生長(zhǎng)曲線(xiàn)及最適生長(zhǎng)條件測(cè)定

      生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定:將菌液按1%的比例接種到100 mL LB培養(yǎng)基中,45 ℃振蕩培養(yǎng),每2 h測(cè)定1次。

      菌株最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期早期的LB菌株培養(yǎng)液0.5 mL接種到5 mL LB培養(yǎng)基中,分別置于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃水浴振蕩培養(yǎng)18 h。

      最適生長(zhǎng)pH值的測(cè)定:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期早期的LB菌株培養(yǎng)液0.5 mL分別接種到pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5的5 mL LB液體培養(yǎng)基中,置于45 ℃水浴振蕩培養(yǎng)18 h。

      以上試驗(yàn)均設(shè)平行。用721型分光光度計(jì)比色測(cè)定D600 nm進(jìn)行生長(zhǎng)條件的分析。

      耐膽鹽試驗(yàn):菌液按1 ∶50(體積比)的接種量分別接種于膽鹽濃度為0、3、6 g/L的液體培養(yǎng)基中,每組重復(fù)3次,45 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h后測(cè)定菌液的D600 nm。

      1.5 產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶試驗(yàn)

      產(chǎn)淀粉酶試驗(yàn):首先配制產(chǎn)淀粉酶初篩試驗(yàn)的MH培養(yǎng)基,121 ℃高壓滅菌15 min,制成平板備用;將分離出來(lái)的A2、A3、A4、A5菌株分別接種于裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中,45 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)(12±2)h;將培養(yǎng)好的A2、A3、A4、A5菌株取5 μL點(diǎn)樣于產(chǎn)淀粉酶培養(yǎng)基上,在(45±1)℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,待長(zhǎng)出單菌落,滴入盧戈氏碘液覆蓋菌落,觀察是否產(chǎn)生透明圈。

      產(chǎn)蛋白酶試驗(yàn):首先配制產(chǎn)蛋白酶初篩試驗(yàn)培養(yǎng)基,121 ℃ 高壓滅菌15 min,制成平板備用;將分離出來(lái)的A2、A3、A4、A5菌株分別接種于裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中,45 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)(12±2)h;將培養(yǎng)好的A2、A3、A4、A5菌株取5 μL點(diǎn)樣于產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基上,在45 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,待長(zhǎng)出單菌落,檢察是否產(chǎn)生蛋白酶水解圈。

      1.6 抑菌試驗(yàn)

      試驗(yàn)菌株菌液、大腸桿菌(ATCC 44102)及沙門(mén)氏菌菌液,分別以體積比1 ∶50(約1×106CFU/mL)的接種量同時(shí)接種于 10 mL 肉湯液體培養(yǎng)基中,另以滅菌生理鹽水替代試驗(yàn)菌株作為陽(yáng)性對(duì)照。每組設(shè)3個(gè)重復(fù),37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。采用平板活菌計(jì)數(shù)法,取樣涂布于麥康凱瓊脂平皿,37 ℃過(guò)夜,紅色菌落為大腸桿菌,其余為沙門(mén)氏菌,記錄大腸桿菌和沙門(mén)氏菌菌落數(shù),計(jì)算各試驗(yàn)菌株對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌率。

      1.7 分子鑒定

      用16S rDNA序列進(jìn)行鑒定,以確定其歸屬。PCR產(chǎn)物送上海捷瑞生物工程有限公司測(cè)序。分別將獲得的16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì),選取相似度95%以上的序列進(jìn)一步分析。然后采用DNAMAN 5.2.9軟件進(jìn)行分析,繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

      1.8 透射電鏡觀察

      處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期早期的細(xì)胞用固定液固定好后,制備超薄切片置于透射電鏡下進(jìn)行結(jié)構(gòu)觀察。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 分離的菌落及形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

      通過(guò)稀釋平板涂抹法分離得到4株芽孢桿菌,將其接種到普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,45 ℃恒溫培養(yǎng)24~48 h后觀察,菌落為圓形,邊緣不規(guī)則,表面有皺襞。挑取單個(gè)菌落涂片,可見(jiàn)呈革蘭陽(yáng)性。透射電鏡觀察看到4株芽孢桿菌細(xì)胞呈直桿狀,常以成對(duì)或鏈?zhǔn)脚帕?,具圓端,都具有明顯的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),且都能明顯觀察到周?chē)芯鐖D1所示。

      2.2 分離株的生化鑒定

      對(duì)4株菌株的細(xì)菌形態(tài)特征、革蘭氏染色觀察以及觸酶與發(fā)酵葡萄糖、木糖、甘露醇、木糖、蔗糖等常規(guī)生化試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

      表1 4株參試菌的生理生化特征

      注:“+”表示陽(yáng)性或能利用;“-”表示陰性或不能利用;“+/-”表示同一屬具體不同菌株之間的細(xì)微差別。

      2.3 最適生長(zhǎng)條件

      2.3.1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定 從0 h開(kāi)始,每2 h測(cè)1次D600 nm,直到30 h,4株菌株基本進(jìn)入穩(wěn)定期。如圖2所示,A2、A3、A4、A5菌株均在12 h達(dá)到對(duì)數(shù)期,分別在26、20、20、 26 h 達(dá)到穩(wěn)定期。

      2.3.2 菌株最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定 將4株菌株置于不同溫度搖床培養(yǎng),在18 h后同時(shí)測(cè)定菌液的D600 nm,以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照,得到的結(jié)果如圖3所示,可見(jiàn)培養(yǎng)溫度對(duì)4株菌株的生長(zhǎng)有一定的影響。在所選溫度范圍內(nèi),菌體生物量隨溫度的變化而變化,當(dāng)培養(yǎng)溫度低于40 ℃時(shí),菌體生長(zhǎng)緩慢;A2、A4、A5菌株培養(yǎng)溫度在40~45 ℃之間時(shí),菌體生長(zhǎng)情況較好,以45℃最好,之后隨著溫度的升高,生長(zhǎng)速度減慢。A3菌株在50 ℃時(shí)菌體生物量達(dá)到最高值。

      2.3.3 菌株最適生長(zhǎng)pH值的測(cè)定 將4株菌株置于不同pH值條件下,在45 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后同時(shí)測(cè)定菌液的D600 nm,以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照,測(cè)得的結(jié)果如圖4所示:初始pH值對(duì)4株菌株生長(zhǎng)有明顯的影響,當(dāng)培養(yǎng)基pH值低于6.0時(shí),菌體生長(zhǎng)緩慢,當(dāng)初始pH值在6.0~7.5之間時(shí),菌體生長(zhǎng)情況較好。A2、A3菌株最適pH值為7.5,A4、A5菌株最適pH值為7.0。

      2.4 耐膽鹽試驗(yàn)

      由圖5可見(jiàn),4株菌株各組的生長(zhǎng)都受到膽鹽的抑制,D600 nm都低于不含膽鹽組,相比較而言,A2菌株耐受性較好。

      2.5 產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶結(jié)果分析

      4株菌株產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶結(jié)果如圖6所示,A2、A3菌株產(chǎn)淀粉酶,A4、A5菌株基本不產(chǎn)淀粉酶(圖6左圖);4株菌株均能產(chǎn)蛋白酶,且A2菌株產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng)(圖6右圖)。

      2.6 抑菌試驗(yàn)

      由表2可見(jiàn),4株菌株對(duì)共同培養(yǎng)24 h的大腸桿菌都沒(méi)有抑制作用;A2、A5菌株對(duì)共培養(yǎng)的沙門(mén)氏菌的抑菌率分別為31.2%、22.9%,其他菌株為0。

      表2 各菌株對(duì)共培養(yǎng)的大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑制效果

      2.7 16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

      測(cè)序獲得的A2、A3、A4和A5菌株16S rDNA基因片段長(zhǎng)度分別為1 277、1 181、1 213和909 bp。利用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST),將所測(cè)菌株A2、A3、A4和A5的16S r DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行比較鑒定,已知A3、A4、A5菌株與Bacilluslicheniformisstrain H37的同源性分別為98%、99%、100%,說(shuō)明A3、A4和A5菌株屬于嗜熱地衣芽孢桿菌屬(Bacilluslicheniformis);已知A2與Bacillussubtilisstrain CC2FG1的同源性是97%,說(shuō)明A2菌株屬于嗜熱枯草芽孢桿菌屬(Bacillussubtilis)。采用DNAMAN 5.2.9軟件繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖7。

      3 討論

      從水產(chǎn)飼料中分離獲得4株菌株,細(xì)菌形態(tài)特征、革蘭氏染色等鑒定結(jié)果顯示,4株菌株與芽孢桿菌相似。由于芽孢細(xì)菌形態(tài)特征及其生理生化特性極其相似,因此僅通過(guò)形態(tài)特征及其生理生化特性只能初步確定這4株菌株為芽孢桿菌?;?6S rDNA特異性PCR擴(kuò)增的檢測(cè)等多種方法結(jié)合使用,經(jīng)鑒定,A2菌株與Bacillussubtilisstrain CC2FG1的同源性是97%,說(shuō)明A2菌株屬于嗜熱枯草芽孢桿菌;A3、A4、A5菌株與Bacilluslicheniformisstrain H37的同源性分別是 98%、99%、100%,說(shuō)明A3、A4和A5菌株屬于嗜熱地衣芽孢桿菌。

      本研究以水產(chǎn)飼料為材料,分離篩選優(yōu)良的芽孢桿菌菌株并對(duì)其進(jìn)行初步鑒定,以此大致了解水產(chǎn)飼料中芽孢桿菌的菌相構(gòu)成。在此基礎(chǔ)上探究了芽孢桿菌對(duì)常見(jiàn)致病菌大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌作用,以期研究結(jié)果能為畜牧農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及微生態(tài)調(diào)節(jié)劑的制備提供前期理論依據(jù)和優(yōu)良的微生物資源。

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