雞球蟲病防治藥物及抗藥性研究*

畢菲菲 郝振凱 孫 霈 于詠蘭 索 勛 劉賢勇

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 100193)

雞球蟲病是由艾美耳屬一種或多種球蟲寄生于雞腸上皮細(xì)胞內(nèi)所引起的原蟲病(汪明,2003)。該病對(duì)養(yǎng)雞業(yè)危害極大,其發(fā)病率達(dá)80%～100%,病死率達(dá)20%～30%,嚴(yán)重時(shí)病死率高達(dá)80%(劉賢勇等，2004)。

目前世界公認(rèn)的雞球蟲種類有7種,分別是柔嫩艾美耳球蟲Eimeriatenella、毒害艾美耳球蟲E.nectrix、和緩艾美耳球蟲E.mitis、堆型艾美耳球蟲E.acervulina、早熟艾美耳球蟲E.precox、布氏艾美耳球蟲E.brunetti和巨型艾美耳球蟲E.maxima，其中危害最為嚴(yán)重的是毒害艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲(索勛等，1998)。Levine(1939)首次發(fā)現(xiàn)磺胺類藥物可以治療雞球蟲病,Grumbles(1948)用磺胺喹噁啉預(yù)防雞球蟲病后,化學(xué)藥物被用于防治雞球蟲病,并逐漸成為控制雞球蟲病的主要手段。目前仍應(yīng)用生產(chǎn)的抗球蟲藥有20余種,按其化學(xué)結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)過(guò)程大致可分為中草藥、化學(xué)合成類、抗生素類抗球蟲藥(李佩國(guó)等，2006)。

1 中草藥

我國(guó)是中草藥資源最豐富的國(guó)家,有關(guān)中草藥驅(qū)殺寄生蟲的功能,早在我國(guó)古代的醫(yī)學(xué)論著中就有記載(史福盛,1997)。中草藥具有抑殺球蟲,使用安全,毒副作用小,且能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能及促進(jìn)雛雞生長(zhǎng),不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn),已得到越來(lái)越多研究學(xué)者的青睞(陳雷等，2013)。

1.1 防治雞球蟲病的中草藥種類

防治雞球蟲病的中草藥大致分為5大類(胡元亮，2006):(1) 驅(qū)蟲類:這類藥物能夠直接殺死球蟲或抑制球蟲生長(zhǎng)發(fā)育,是防治雞球蟲病的常用藥。常見的有常山、仙鶴草、使君子、冰片、鴉膽子、百部、雄黃等藥物, 其中最常見的藥物是常山。(2)清熱燥濕類:常見藥物有苦參、黃芩、黃柏、黃連、秦皮、白頭翁等。(3)清熱解毒類:一類具有解毒、利濕、清熱的藥物。常見的有青蒿、白茅根、馬齒莧、柴胡、穿心蓮、地錦草、蒲公英等。(4)補(bǔ)益氣血類:提高機(jī)體抵抗力,增強(qiáng)機(jī)體殺蟲、驅(qū)蟲作用的一類藥物。如當(dāng)歸、黨參、甘草、黃芪、熟地等。(5)活血止血類:用以對(duì)癥治療球蟲病的出血的一類藥物。如丹參、桃仁、地榆炭、仙鶴草、白芨等。上述中藥方劑之間按照一定的組方法則進(jìn)行配伍,以達(dá)到最佳組合效應(yīng),從而取得最好的防治雞球蟲病的效果(周作勇等，2005)。

1.2 中草藥單方、復(fù)方及其藥效

目前用來(lái)防治雞球蟲病的中草藥單方主要有青蒿、常山、白頭翁、苦參等。常山又名鹵喹酮,它的主要成分為常山酮,常山酮原粉能夠用于多種球蟲的防治；鉤藤含有鉤藤堿,對(duì)球蟲裂殖子有抑殺作用；蛹蟲草這種食物菌菌糠用來(lái)飼喂肉雞、蛋雞,可提高產(chǎn)量,改善品質(zhì)。中草藥防治雞球蟲病仍以復(fù)方制劑的研制與應(yīng)用為主，不同中藥的組方及不同劑型經(jīng)過(guò)科學(xué)組方、合理搭配,使各藥物相互協(xié)調(diào),產(chǎn)生全方位的協(xié)調(diào)作用和對(duì)機(jī)體有利因子的整體調(diào)動(dòng),從而達(dá)到抗蟲,治病的目的。

表1 中草藥單方、復(fù)方防治雞球蟲病的療效Tab.1 Efficacy of Single-herb, multi-herb prescription for prevention and treatment of chicken coccidiosis

續(xù)表1Tab.lContinued

試驗(yàn)材料Experiment material評(píng)價(jià)指標(biāo)Criteria藥名Drug(s)蟲株,攻蟲劑量Species, Dosage劑量, 給藥方式,用藥時(shí)間Dosage, Administration, Days存活率Survival rate(%)相對(duì)增重率Relative weight gain rateACI參考文獻(xiàn)References- E.T8.0×10415 %、拌料(Mixing)0-8100(100)102.6(104.4)188.3(186.7)鄭明學(xué)等,2001- E.T8.0×1041%、拌料(Mixing)(-2)-7100(100)101.8(96.2)179.8(174.2)顏 卉等,2005- E.MA1×1051.0 g/mL、飲水(Drinking)(-2)-890(80)84.9(46.6)161.9(80.2)林青等,2011- E.T5.0×10460 g/kg、拌料(Mixing)(-2)-8100(100)68.9(74.9)157.9(166.4)王天奇等,2004球克星 QiukexingE.T5.0×1042 g/kg、拌料(Mixing)(-2)-8100(98)94.5(78.0)171.2(142.7)劉詩(shī)柱等,2011- E.T5.0×1051 ml、飲水(Drinking)0-8100(100)29.4(68.5)120.1(156.8)康 明等,2009常青克球靈KeqiulingE.T8.0×1042%、拌料(Mixing)0-7100(73.3)92.3(59.0)186.3(73.8)劉秀玲,2014- E.T8.0×1040.5 %、拌料(Mixing)0-5100(100)89.5(90.2)167.5(175.2)周翠珍,2007- E.T1.0×1052%、拌料(Mixing)(-2)-775(83.3)85.0(64.0)146.0(128.3)陳雷等,2013- E.T5.0×1040.1%、拌料(Mixing)0-7100(100)101.9(99.9)191.9(196.9)楊靜靜等,2015- MIX1×10510 g/L、飲水(Drinking)0-785(95)87.5(91.4)165.7(181.7)郭永剛等,2014

注:(),各實(shí)驗(yàn)組對(duì)照藥物的參數(shù)值; -,未命名。

Note: (), The parameter values of the control drugs in each experimental group.-, Unnamed.

通過(guò)人工感染艾美耳球蟲孢子化卵囊, 以存活率、相對(duì)增重率、平均病變值、卵囊值、抗球蟲指數(shù)進(jìn)行判定,結(jié)果證明不同中草藥的不同配比可明顯改善雞的增重率和存活率,減少卵囊排出量,提高飼料利用率,有顯著的抗球蟲作用,其效果甚至優(yōu)于一部分化學(xué)藥物。

1.3 中草藥防治雞球蟲病作用機(jī)理

對(duì)于中草藥作用機(jī)理的研究,目前認(rèn)為中草藥能夠防治雞球蟲病主要體現(xiàn)在以下3個(gè)方面: (1)抑制球蟲的發(fā)育:中草藥抗球蟲主要是通過(guò)殺死球蟲或抑制球蟲發(fā)育來(lái)發(fā)揮作用的。張文香等(2005)通過(guò)研究中草藥復(fù)方處理后球蟲卵囊的孢子化率,發(fā)現(xiàn)所用中草藥對(duì)球蟲卵囊的孢子化率有明顯的抑制作用。(2)增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫功能:一些中草藥能顯著提高機(jī)體的非特異性和特異性免疫力,以增強(qiáng)機(jī)體的抗病力。葛凱等(2009)通過(guò)自制的中草藥復(fù)方制劑，研究其對(duì)球蟲感染雞的血液成分影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)中藥方劑能顯著提高雞體血清中的IgG、IgM、IgA含量，維持血糖穩(wěn)定在正常水平，并能明顯提高溶菌酶等指標(biāo)的水平。樊福好等(2000)研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可提高球蟲感染雞的淋巴細(xì)胞玫瑰花環(huán)形成率、球蟲感染雞的刺激指數(shù)(LT率),并提高健康雞的 C3b受體花球形成率。(3)緩解癥狀:部分中草藥能夠緩解球蟲感染雞的臨床癥狀,如柴胡、白頭翁等藥物的解熱作用；馬齒莧、苦參等藥物的止痢作用；地榆炭、仙鶴草等藥物的止血作用等。

由于中草藥抗球蟲制劑中的成分復(fù)雜,對(duì)復(fù)方制劑作用機(jī)理的研究,僅從中獸醫(yī)理論、組方法則和治療效果的觀察上來(lái)推理還不完善,還需結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的方法來(lái)檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

2 化學(xué)合成藥物

第一個(gè)作為連續(xù)(預(yù)防)給藥的抗球蟲化學(xué)合成藥物是磺胺喹噁啉(Grumblesetal.,1948)。目前,化學(xué)合成的抗球蟲藥物種類很多,不同種類的藥物效果上存在一定的差異(表2)。

3 聚醚類離子載體抗生素

從上個(gè)世紀(jì)50年代起,聚醚類離子載體抗生素就被用于雞球蟲病的防治。聚醚類抗生素類藥物主要作用在球蟲的細(xì)胞膜上,使水分子以及一些陽(yáng)離子通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入球蟲細(xì)胞內(nèi),破壞細(xì)胞膜的內(nèi)外平衡,最終導(dǎo)致球蟲因?yàn)檫^(guò)度的腫脹而死亡,從而達(dá)到防治疾病的目的。聶奎等(1995)通過(guò)對(duì)海賽克斯雛雞人工接種感染E.tenella孢子化卵囊1×105，用雞球素5 mg拌飼預(yù)防,使用存活率、病變值、卵囊值、相對(duì)增重率、抗球蟲指數(shù)(ACI)評(píng)估雞球素的療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其ACI值為172.2，而對(duì)照藥物氯苯胍的ACI為28.2。聶奎等(2000)將羅曼公雛經(jīng)口人工接種感染E.tenella孢子化卵囊1×105，通過(guò)存活率、相對(duì)增重率、盲腸病變計(jì)分、血便記分和抗球蟲指數(shù)對(duì)4種藥物進(jìn)行藥物療效判定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)球安、球佳為高效抗球蟲藥，其抗球蟲指數(shù)為189.375和180.75，而加福和球凈抗球蟲指數(shù)僅為99.25和105.75。劉小艷等(2010)對(duì)經(jīng)口人工感染1.0×105個(gè)/只E.tenella孢子化卵囊的雛雞按100 kg飲水中分別添加100 g/L 尼卡巴嗪混懸液25、50、100 mL的劑量混飲連續(xù)給藥5 d,其抗球蟲指數(shù)分別為189.7、189.9、184.2,屬高效抗球蟲藥。

表2 化學(xué)合成藥物防治雞球蟲病的療效Tab.2 Efficacy of chemical synthetic drugs for prevention and treatment of chicken coccidiosis

4 雞球蟲抗藥性研究

4.1 抗藥性的定義

抗藥性一般被認(rèn)為是藥物控制寄生蟲的失敗,但抗藥性的正式定義是對(duì)藥物敏感性的轉(zhuǎn)變。世界衛(wèi)生組織(1965)將抗藥性定義為:“在現(xiàn)場(chǎng)情況下,某一寄生蟲蟲株在使同種寄生蟲毀滅和抑制其繁殖的藥物濃度下仍能繁殖和生存的能力。這種對(duì)藥物的抵抗力可能是相對(duì)的或完全的”。

4.2 抗藥性的調(diào)查研究

為了解我國(guó)雞球蟲抗藥性的發(fā)生和流行情況,為養(yǎng)雞生產(chǎn)中正確選擇高效抗球蟲藥、制訂合理用藥方案提供科學(xué)依據(jù),并為現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)球蟲抗藥性提供切實(shí)可行的判定方法和標(biāo)準(zhǔn),國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)不同地區(qū)艾美耳球蟲對(duì)不同藥物的抗藥性進(jìn)行了調(diào)查研究(表3)。

目前報(bào)道的已產(chǎn)生抗藥性的藥物種類有地克珠利、馬杜霉素、鹽霉素、拉沙里菌素、莫能霉素、氯羥吡啶、氯苯胍、氨丙啉、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、常山酮、磺胺氯吡嗪鈉、磺胺喹噁啉鈉、球痢靈、托曲珠利、球佳、杜球、欲可胖、球安、海南霉素等20多種抗球蟲藥物。在檢測(cè)艾美耳球蟲對(duì)不同藥物的抗藥性中83.0%蟲株(44/53)對(duì)地克珠利、92.5%蟲株(37/40)對(duì)馬杜霉素、92.3%蟲株(24/26)對(duì)鹽霉素、75.0%蟲株(3/4)對(duì)拉沙里菌素、50.0%蟲株(7/14)對(duì)莫能霉素、90.9%蟲株(10/11)對(duì)氯羥吡啶、94.1%蟲株(16/17)對(duì)氯苯胍、62.5%蟲株(10/16)對(duì)氨丙啉、20.0%蟲株(1/5)對(duì)癸氧喹酯、76.2%蟲株(16/21)對(duì)尼卡巴嗪、100%蟲株(2/2)對(duì)常山酮、82.3%蟲株(14/17)對(duì)托曲珠利、93.3%蟲株(14/15)對(duì)磺胺氯吡嗪鈉、100%蟲株(14/14)對(duì)磺胺喹噁啉鈉、80.0%蟲株(4/5)對(duì)球痢靈具有抗藥性。

從國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)不同地區(qū)不同蟲株的抗藥性調(diào)查結(jié)果來(lái)看,球蟲抗藥性的問(wèn)題在我國(guó)確實(shí)是一個(gè)非常嚴(yán)重的問(wèn)題,對(duì)我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)構(gòu)成了極大的威脅,應(yīng)加強(qiáng)球蟲抗藥性研究和檢測(cè)工作,克服用藥的盲目性。在科學(xué)原則的指導(dǎo)下,適時(shí)輪換用藥或穿梭用藥,防止抗藥蟲株的出現(xiàn)。

4.3 抗藥機(jī)制研究

有鑒于艾美耳球蟲抗藥性的普遍性,許多球蟲病研究學(xué)者進(jìn)行了各種嘗試來(lái)解析球蟲抗藥性的機(jī)制。球蟲學(xué)研究領(lǐng)域的權(quán)威科學(xué)家Chapman(1984)博士認(rèn)為抗藥性是對(duì)存在于球蟲群體中突變體定向選擇的結(jié)果。找出與抗藥性產(chǎn)生相關(guān)的基因,發(fā)現(xiàn)與抗藥性相關(guān)的蛋白差異表達(dá),對(duì)新藥的研發(fā)以及抗藥性分子檢測(cè)方法的建立具有重要的意義。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了大量的研究,獲得了許多重要的信息。對(duì)于地克珠利抗藥性機(jī)制的研究，姜連連等(2005)利用雙向電泳技術(shù),對(duì)柔嫩艾美耳球蟲地克株利抗藥株與敏感株的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜進(jìn)行差異比較和分析,發(fā)現(xiàn)兩者之間差異有5個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn),其中2個(gè)蛋白質(zhì)分別為球蟲子孢子表面抗原TA4和熱休克蛋白Hsp70,另外兩種為真核細(xì)胞的功能蛋白。對(duì)于馬杜霉素抗藥性機(jī)制的研究，姜連連等(2006)利用雙向電泳技術(shù),對(duì)柔嫩艾美耳球蟲馬杜拉霉素抗藥株與敏感株的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜進(jìn)行差異比較和分析,發(fā)現(xiàn)兩者之間差異有4個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn),其中1種蛋白質(zhì)為球蟲子孢子表面抗原 TA4。另外2種蛋白質(zhì)與瘧原蟲的 Pfj1和線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受體Tom40具有很高的同源性。安健(2006)對(duì)馬杜霉素敏感蟲株和抗藥蟲株進(jìn)行mRNA差異顯示比較分析，結(jié)果顯示HCD1序列來(lái)自馬杜霉素敏感蟲株,而在抗藥蟲株中的沉默，AGD5在敏感蟲株裂殖子中沉默,HAD8-2在抗藥蟲株中沉默。對(duì)于地克珠利與馬杜霉素抗藥性機(jī)制研究：韓紅玉等(2005)利用抑制消減雜交(SSH)方法，通過(guò)兩輪雜交和兩次PCR分別構(gòu)建了富含兩個(gè)抗藥株孢子化卵囊與敏感株孢子化卵囊之間差異表達(dá)基因的消減cDNA文庫(kù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有4個(gè)cDNA 片段可能是新基因片段，與地克珠利抗藥株的產(chǎn)生有關(guān)；有3個(gè)新的cDNA片段可能與馬杜拉霉素抗藥株的產(chǎn)生有關(guān)。蔡蘭等(2006)分析比較柔嫩艾美耳球蟲地克珠利和馬杜拉霉素抗藥株與敏感株孢子化卵囊18S rDNA基因的差異，結(jié)果顯示, ETAM株有3個(gè)堿基發(fā)生突變;ETAD株有l(wèi)個(gè)堿基發(fā)生突變。劉文江等(2004)對(duì)柔嫩艾美球蟲馬杜拉霉素、地克珠利抗藥株及其同母源敏感株第二代裂殖子的蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳,構(gòu)建了穩(wěn)定的雙向電泳圖譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)地克珠利抗藥株和馬杜拉霉素抗藥株各有4個(gè)表達(dá)差異點(diǎn)。對(duì)于鹽霉素、拉沙里菌素抗藥性機(jī)制研究：余麗蕓等(1999)采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳,進(jìn)行了鹽霉素、拉沙里菌素抗藥蟲株與敏感蟲株間乳酸脫氫酶(LDH), 葡萄糖磷酸異構(gòu)酶(GPI)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)等同工酶的分析。柔嫩艾美耳球蟲抗性蟲株的LDH 酶譜是2條帶,敏感蟲株是3條帶。國(guó)內(nèi)學(xué)者采用多種技術(shù)對(duì)遺傳背景相同的球蟲抗藥株和敏感株之間基因和蛋白表達(dá)差異進(jìn)行了大量研究,且對(duì)不同藥物抗雞球蟲的分子作用機(jī)理研究著重于對(duì)藥物作用可能相關(guān)的基因和蛋白。這些相關(guān)基因和蛋白是球蟲入侵、代謝及信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵分子。藥物作用后，這些基因或蛋白的表達(dá)量發(fā)生了不同程度的變化，但是有關(guān)某種藥物確切的調(diào)控機(jī)理及其相互之間的作用關(guān)系，還需要進(jìn)一步深入的研究。

表3 國(guó)內(nèi)關(guān)于雞球蟲抗藥性的研究調(diào)查Tab.3 Researches on the resistance of chicken coccidia in China

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室分離或誘導(dǎo)抗藥球蟲株，比較藥物敏感株和抗藥株在這些藥物可能作用的基因，篩選可能的抗藥基因的突變區(qū)域和突變位點(diǎn)，尋找藥物作用的靶基因位點(diǎn)，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)這些基因位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證?？骨蛳x藥物的靶基因或靶基因位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)對(duì)深入揭示球蟲對(duì)特定藥物抗藥性產(chǎn)生機(jī)制、建立球蟲抗藥性分子檢測(cè)技術(shù)、預(yù)防和控制抗藥性的產(chǎn)生，以及新型作用機(jī)制抗球蟲藥的研制具有重要意義。

5 結(jié)語(yǔ)

由于雞球蟲病對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的危害十分嚴(yán)重,人們對(duì)雞球蟲病及其藥物防治的研究從未間斷過(guò),并取得了很大的進(jìn)展。雖然人們研制和開發(fā)了很多種抗球蟲藥物控制雞球蟲病的發(fā)生,但是該病的危害仍相當(dāng)嚴(yán)重。藥物在一段較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)仍然是防治雞球蟲病的主要武器。球蟲對(duì)藥物極易產(chǎn)生耐藥性,因此加強(qiáng)藥物開發(fā)的研究勢(shì)在必行。研制中西藥復(fù)方制劑用于防治雞球蟲病將是一個(gè)新的思路。藥物開發(fā)除不斷挖掘新藥外,需不斷改變劑型、發(fā)揮老藥的作用。同時(shí)還應(yīng)注意進(jìn)行抗球蟲藥與飼料中其他藥物的配合使用方面的研究。