齊興財(cái)，秦曉東，甘曉麗，張淑敏，馬友記，李志勇*

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046)

口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒感染引起(foot-and-mouth disease virus， FMDV)一種急性、高度傳染性的偶蹄類動(dòng)物疫病[1-3]。FMDV易染動(dòng)物包括牛、豬、綿羊、山羊和超過(guò)70種的野生動(dòng)物物種[4]，嚴(yán)重妨礙了畜牧業(yè)健康發(fā)展[5]。目前，疫苗接種被廣泛用于預(yù)防FMDV感染，但由于該病毒有七個(gè)血清型，在幾個(gè)血清型之間缺乏交叉保護(hù)，血清型相同的不同毒株也可能沒(méi)有相互的保護(hù)作用[6]，還沒(méi)有其他有效的方法來(lái)阻止口蹄疫的流行[7]。因此應(yīng)該加大力度研究防控該病。

自從RNAi技術(shù)被發(fā)明以來(lái)[8]，RNAi技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于抗病育種研究并且在抗病毒領(lǐng)域的研究中有了重大的突破，有望成為疾病預(yù)防的一種新型手段[9-11]。研究表明，利用RNAi技術(shù)靶向口蹄疫病毒的VP1、3D蛋白基因可以有效抑制FMDV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，并且成功地生產(chǎn)了具有抗口蹄疫病毒的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[12-14]。目前利用RNAi技術(shù)靶向口蹄疫病毒的3C基因的研究比較少，本研究針對(duì)ON口蹄疫病毒的VP1、3C、3D基因，構(gòu)建shRNA重組表達(dá)質(zhì)粒，在細(xì)胞水平上挑選出能夠高效抑制ON 口蹄疫病毒的干擾片段，并成功制備含有慢病毒干擾載體的慢病毒，為后續(xù)抗口蹄疫病毒的轉(zhuǎn)基因羊生產(chǎn)培育奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、細(xì)胞和載體 ON 口蹄疫毒株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所保存； DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；倉(cāng)鼠腎細(xì)胞BHK21、人腎上皮細(xì)胞293T、RNAi表達(dá)載體PLKO.1-TRC、慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2.G和psPAX2均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰酶和胎牛血清均購(gòu)自GIBCO公司；嘌呤霉素、Lipofectamine 2000 Transfection Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、RNA提取試劑Trizol均購(gòu)自Invitrogen公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；AgeⅠ、EcoRⅠ、NcoⅠ、T4DNA 連接酶、DNA Ladder Marker等常用試劑購(gòu)自從大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則和引物設(shè)計(jì)的方法，通過(guò)Thermofisher在線輔助設(shè)計(jì)工具，合成shRNA對(duì)應(yīng)的DNA序列(表1)。這些序列由深圳華大基因有限公司合成。

1.2.2 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 根據(jù)PLKO.1-TRC的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將合成的正義鏈和反義鏈DNA片段用去離子水溶解，終濃度為20 μmol·L-1，然后各取5 μL PCR儀上退火形成雙鏈。對(duì)PLKO.1-TRC質(zhì)粒載體經(jīng)AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切后得到7 kb的片段膠回收純化，然后與退火生成的雙鏈小片段連接，分別命名為PLKO.1-VP1-1、PLKO.1-VP1-2、PLKO.1-3C-1、 PLKO.1-3C-2、PLKO.1-3D-1、PLKO.1-3D-2；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑取陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和NcoⅠ酶切鑒定，并送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序，鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。

1.2.3 病毒的復(fù)制和TCID50的測(cè)定 用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基對(duì)BHK21細(xì)胞傳代培養(yǎng)，至生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)棄掉培養(yǎng)基，加入100 μL的ON 口蹄疫病毒與2 mL的DMEM 培養(yǎng)1 h后，換液由含有2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞病變至80%左右收集病毒液，-80 ℃反復(fù)凍融3次并離心，收集上清。正常傳代培養(yǎng)BHK21細(xì)胞至生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%左右，將病毒懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋(10-1～10-10)，每孔加入100 μL稀釋好的病毒液，72 h后記錄不同梯度出現(xiàn)的細(xì)胞病變孔數(shù)，然后按照Reed-Muench方法計(jì)算病毒的TCID50[15]。

表1 合成shRNA所對(duì)應(yīng)的DNA序列

Table 1 Synthesized DNA sequence correlated to shRNA

shRNA引物名稱NameofshRNAprimershRNA序列(5'-3')SequencesofshRNA(5'-3')VP1-1F:5'CCGGGACAACACTACCAACCCAACACTCGAGTGTTGGGTTGGTAGTGTTGTCTTTTTG3'R:5'AATTCAAAAAGACAACACTACCAACCCAACACTCGAGTGTTGGGTTGGTAGTGTTGTC3'VP1-2F:5'CCGGGGCAACTCGTGTGACTGAACTCTCGAGAGTTCAGTCACACGAGTTGCCTTTTTG3'R:5'AATTCAAAAAGGCAACTCGTGTGACTGAACTCTCGAGAGTTCAGTCACACGAGTTGCC3'3C-1F:5'CCGGGCGAAGCCCTTACTTACAAGGCTCGAGCCTTGTAAGTAAGGGCTTCGCTTTTTG3R:5'AATTCAAAAAGCGAAGCCCTTACTTACAAGGCTCGAGCCTTGTAAGTAAGGGCTTCGC3'3C-2F:5'CCGGGGATACTGTTCGTGCGTTTCCCTCGAGGGAAACGCACGAACAGTATCCTTTTTG3'R:5'AATTCAAAAAGGATACTGTTCGTGCGTTTCCCTCGAGGGAAACGCACGAACAGTATCC3'3D-1F:5'CCGGGCAAAGATTTGGCACACATTTCTCGAGAAATGTGTGCCAAATCTTTGCTTTTTG3'R:5'AATTCAAAAAGCAAAGATTTGGCACACATTTCTCGAGAAATGTGTGCCAAATCTTTGC3'3D-2F:5'CCGGGGACCATACAGGAGAAGTTGACTCGAGTCAACTTCTCCTGTATGGTCCTTTTTG3'R:5'AATTCAAAAAGGACCATACAGGAGAAGTTGACTCGAGTCAACTTCTCCTGTATGGTCC3'

1.2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞后接毒并提取總的RNA 正常傳代培養(yǎng)BHK21細(xì)胞至生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右，按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)，將重組質(zhì)粒PLKO.1-VP1-1、PLKO.1-VP1-2、PLKO.1-3C-1、PLKO.1-3C-2、PLKO.1-3D-1 和PLKO.1-3D-2分別轉(zhuǎn)入BHK21細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加入200個(gè)TCID50的ON 口蹄疫病毒。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，收集細(xì)胞毒液，采用Trizol法提取BHK21細(xì)胞的總RNA，按照說(shuō)明書(shū)方法操作提取RNA。將RNA保存至-80 ℃待用。

1.2.5 Real-time PCR 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒RNA 選擇FMDV基因組中3D基因的一段保守序列作為標(biāo)準(zhǔn)品序列設(shè)計(jì)引物和探針。序列如下：F:5′-ACTGGGTTTTAYAAACCTGTGATG-3′，R:5′-TCAACTTCTCCTGKATGGTCCCA-3′，探針5′-ATCCTCTCCTTTGCACGC-3′，其中標(biāo)準(zhǔn)品序列全長(zhǎng)130 bp[16]，然后建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將保存至-80 ℃的RNA取出，根據(jù)SuperScript Ⅲ Platinum one-Step Quantitative RT-PCR System 說(shuō)明書(shū)操作。反應(yīng)體系如下:2×ReactionMix 12.5 μL，50 nmol·L-1ROX Reference Dye，250 nmol·L-1探針，上、下游引物500 nmol·L-1，1 μL 模板，最終用 RNase-free water 加至 25 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 15 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)。最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6 含重組質(zhì)粒的細(xì)胞測(cè)定病毒TCID50正常傳代培養(yǎng)BHK21細(xì)胞至生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右，按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)，將重組質(zhì)粒PLKO.1-VP1-1、PLKO.1-VP1-2、PLKO.1-3C-1、PLKO.1-3C-2、PLKO.1-3D-1 和PLKO.1-3D-2分別轉(zhuǎn)入BHK21細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，將含有重組質(zhì)粒的細(xì)胞分別轉(zhuǎn)移至96孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%左右，將病毒懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋(10-1～10-10)，每孔加入100 μL稀釋好的毒液，72 h后記錄不同梯度出現(xiàn)的細(xì)胞病變孔數(shù)，然后按照Reed-Muench方法計(jì)算病毒的TCID50。最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 慢病毒的制備和穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選 正常傳代培養(yǎng)293T至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，將抑制病毒復(fù)制效果比較好的PLKO.1-VP1-2、PLKO.1-3D-1質(zhì)粒分別與慢病毒包裝載體psPAX2、pMD2.G用FuGENE?Transfection Reagent共轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞，分別于36、60 h后收集細(xì)胞液，得到慢病毒。使用慢病毒感染BHK21細(xì)胞48 h后，用5 μg·mL-1的嘌呤霉素篩選細(xì)胞，鑒定慢病毒是否制備成功并且得到穩(wěn)定的細(xì)胞系。

1.2.8 Real-time PCR 檢測(cè)慢病毒干擾載體對(duì)FMDV抑制效率 對(duì)穩(wěn)定篩選的細(xì)胞傳代培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右，每孔加入200個(gè)TCID50的ON 口蹄疫病毒。收集培養(yǎng)12、18、24 h后的細(xì)胞毒液，采用Trizol法提取BHK21細(xì)胞的總RNA并使用Real-time PCR 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒RNA。最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.9 含慢病毒干擾載體的細(xì)胞測(cè)定病毒的TCID50對(duì)穩(wěn)定篩選的細(xì)胞傳代培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%左右，將病毒懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋(10-1～10-10)，每孔加入100 μL稀釋好的病毒液，72 h后記錄不同梯度出現(xiàn)的細(xì)胞病變孔數(shù)，然后按照Reed-Muench方法計(jì)算病毒的TCID50。

2 結(jié) 果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

連接轉(zhuǎn)化后，提取轉(zhuǎn)化菌質(zhì)粒DNA，經(jīng)EcoRⅠ和NcoⅠ酶切鑒定，得到5和2 kb的兩條帶(圖1)。對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果證明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒，分別命名為PLKO.1-VP1-1、PLKO.1-VP1-2、PLKO.1-3C-1、PLKO.1-3C-2、PLKO.1-3D-1、PLKO.1-3D-2。

M. DL5000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1. PLKO.1-VP1-1； 2.PLKO.1-VP1-2；3.PLKO.1-3C-1；4.PLKO.1-3C-2；5. PLKO.1-3D-1； 6.PLKO.1-3D-2重組質(zhì)粒雙酶切鑒定M.DL5000 marker；1. PLKO.1-VP1-1；2.PLKO.1-VP1-2；3.PLKO.1-3C-1；4.PLKO.1-3C-2；5. PLKO.1-3D-1；6.PLKO.1-3D-2 double enzyme identification of recombinant plasmid圖1 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.1 Double enzyme identification of recombinant plasmid

2.2 病毒TCID50的測(cè)定和RT-PCR 檢測(cè)

使用正常的BHK21細(xì)胞測(cè)定病毒的TCID50為10-5.875·100 μL-1。將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，并進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，根據(jù)起始的濃度值和循環(huán)CT值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2A)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得知，擴(kuò)增循環(huán)CT值與模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù)R2=0.999，表明檢測(cè)數(shù)據(jù)比較可靠。將含有重組質(zhì)粒的細(xì)胞，每孔加入200 個(gè)TCID50的ON 口蹄疫病毒，12 h后收集細(xì)胞毒液，提取總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。重組質(zhì)粒PLKO.1-VP1-1的抑制效率為86.06%、PLKO.1-VP1-2的抑制效率為93.2%、PLKO.1-3C-1的抑制效率為71.5%、PLKO.1-3C-2的抑制效率為84.1%、PLKO.1-3D-1的抑制效率為90.8%、PLKO.1-3D-2的抑制效率為87.3%(圖2B)。根據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明重組質(zhì)?？捎行У匾种艶MDV的復(fù)制。

2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞后病毒TCID50的測(cè)定

使用正常BHK21細(xì)胞和分別含有重組質(zhì)粒的細(xì)胞測(cè)定病毒的TCID50，得到對(duì)照細(xì)胞測(cè)定病毒的TCID50為10-5.875·100 μL-1，含有重組質(zhì)粒PLKO.1-VP1-1的細(xì)胞測(cè)定病毒的TCID50為10-5.041·100 μL-1、含有重組質(zhì)粒PLKO.1-VP1-2的細(xì)胞測(cè)定病毒的TCID50為10-4.725·100 μL-1、含有重組質(zhì)粒PLKO.1-3C-1的細(xì)胞測(cè)定病毒的TCID50為10-5.333·100 μL-1、含有重組質(zhì)粒PLKO.1-3C-2的細(xì)胞測(cè)定病毒的TCID50為10-5.083·100 μL-1、含有重組質(zhì)粒PLKO.1-3D-1的細(xì)胞測(cè)定病毒的TCID50為10-4.83·100 μL-1、含有重組質(zhì)粒PLKO.1-3D-2的細(xì)胞測(cè)定病毒的TCID50為10-4.958·100 μL-1。結(jié)果表明，對(duì)照細(xì)胞測(cè)定的病毒TCID50無(wú)變化而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞測(cè)定病毒的TCID50下降顯著(圖3A)，而且PLKO.1-VP1-1的抑制效率為85.3%、PLKO.1-VP1-2的抑制效率為92.9%、PLKO.1-3C-1的抑制效率為71.3%、PLKO.1-3C-2的抑制效率為84.1%、PLKO.1-3D-1的抑制效率為90.8%、PLKO.1-3D-2的抑制效率為87.8%(圖3B)。

A. 3D標(biāo)準(zhǔn)曲線; B. FMDV RNA表達(dá)量的計(jì)算; ***. P<0. 01A. Standard curve FMDV 3D gene; B. The calculation FMDV RNA expression quantity; ***. P<0.01圖2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞后FMDV RNA表達(dá)量Fig.2 Recombinant plasmid transfection BHK21 cells after FMDV RNA expression quantity

2.4 RT-PCR 檢測(cè)慢病毒干擾載體對(duì)FMDV抑制效率

將收集得到的慢病毒感染BHK21細(xì)胞，使用5 μg·mL-1嘌呤霉素篩選。發(fā)現(xiàn)未感染慢病毒干擾載體的細(xì)胞4 d以后死亡，而試驗(yàn)組細(xì)胞正常存活，證明成功構(gòu)建慢病毒。傳代培養(yǎng)篩選出的細(xì)胞，得到穩(wěn)定的細(xì)胞系。將篩選穩(wěn)定的細(xì)胞轉(zhuǎn)入6孔板中，每孔加入200個(gè)TCID50的ON口蹄疫病毒。觀察12、18、24 h后細(xì)胞的病變情況并提取細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。12 h 慢病毒干擾載體PLKO.1-VP1-2的抑制效率為95.49%、PLKO.1-3D-1的抑制效率為92.4%；18 h慢病毒干擾載體PLKO.1-VP1-2的抑制效率為94.82%、PLKO.1-3D-1的抑制效率為89.9%；24 h 慢病毒干擾載體PLKO.1-VP1-2的抑制效率為94.67%、PLKO.1-3D-1的抑制效率為88.3% (圖4)。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明慢病毒干擾載體可以有效地抑制FMDV的復(fù)制。

A.測(cè)定病毒的效價(jià); B.計(jì)算對(duì)病毒復(fù)制的抑制；**. 0.01

***. P<0.01圖4 BHK21穩(wěn)定細(xì)胞系感染FMDV后FMDV RNA量Fig.4 BHK21 stable cell line FMDV RNA expression amount after FMDV infection

2.5 含有慢病毒干擾載體的細(xì)胞測(cè)定病毒的TCID50

使用正常BHK21細(xì)胞和篩選穩(wěn)定的細(xì)胞測(cè)定病毒的TCID50，得到對(duì)照細(xì)胞測(cè)定病毒的TCID50為10-5.875·100 μL-1，含有慢病毒干擾載體PLKO.1-VP1-2的細(xì)胞測(cè)定病毒的TCID50為10-4.542·100 μL-1、含有慢病毒干擾載體PLKO.1-3D-1的細(xì)胞測(cè)定病毒的TCID50為10-4.725·100 μL-1。結(jié)果表明對(duì)照細(xì)胞測(cè)定的病毒TCID50無(wú)變化而含有慢病毒干擾載體的細(xì)胞測(cè)定病毒的TCID50下降顯著(圖5A)而且PLKO.1-VP1-2的抑制效率為95.3%、PLKO.1-3D-1的抑制效率為92.9%(圖5B)。

A．測(cè)定病毒的效價(jià)；B.計(jì)算對(duì)病毒的抑制； ***.P<0.01A. The determination of virus titer; B. The calculation of Inhibition efficiency of virus; ***. P<0.01圖5 含慢病毒干擾載體的細(xì)胞測(cè)定病毒的TCID50Fig.5 The TCID50 of the FMDV in cells with lentiviral vector

3 討 論

FMDV復(fù)制速度快、周期短、傳染力強(qiáng)，在全球大部分的地區(qū)流行，嚴(yán)重阻礙了世界畜牧業(yè)的發(fā)展，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[17]。目前還沒(méi)有特異針對(duì)該病的治療方法，主要采用疫苗免疫接種的方法，但接種疫苗7 d后才能引起有效的保護(hù)反應(yīng)，不能及時(shí)控制病毒的傳播與復(fù)制，而且此種方法在生產(chǎn)過(guò)程中容易造成活病毒的逃逸或者免疫動(dòng)物產(chǎn)生新的變異等弊端[18]。在之前的報(bào)道中，證實(shí)RNAi技術(shù)可以抑制FMDV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制并且取得了良好的效果[19]。3D、3C、VP1是口蹄疫病毒復(fù)制過(guò)程中的主要蛋白，均可選為RNAi的目標(biāo)[20]。本研究使用RNAi干擾技術(shù)針對(duì)ON口蹄疫病毒3D、3C、VP1基因的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)靶序列，從而有效地抑制ON口蹄疫病毒的復(fù)制。

現(xiàn)今抗病毒感染的有效方法之一就是利用RNAi技術(shù)在體內(nèi)外抑制病毒的復(fù)制，并且該技術(shù)已經(jīng)取得了深遠(yuǎn)的進(jìn)步[21]。目前使用最多的是將人工設(shè)計(jì)合成的siRNA片段克隆到表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)入整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)讓siRNA 表達(dá)，引起相關(guān)的酶復(fù)合物與靶序列mRNA相結(jié)合，從而使特定的目的基因不表達(dá)或表達(dá)水平降低[22]。針對(duì)病毒靶基因的選擇、針對(duì)病毒靶基因引物的設(shè)計(jì)合成對(duì) RNA干擾效果影響很大，因此靶基因的選擇對(duì)干擾效果非常的重要[23]。本研究針對(duì)ON株口蹄疫病毒3D、3C、VP1基因的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)了6對(duì)靶向shRNA，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK21細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)沉默3D、3C、VP1基因的表達(dá)，從而抑制病毒蛋白的合成，最終降低了病毒的復(fù)制效率。通過(guò)RT-PCR 和病毒TCID50的測(cè)定，結(jié)果表明含有重組質(zhì)粒組與陽(yáng)性對(duì)照相比其抑制率在71.5%～93.2%，其中PLKO.1-VP1-2和PLKO.1-3D-1的抑制效果最為明顯。本研究成功構(gòu)建了靶向ON口蹄疫病毒的重組表達(dá)質(zhì)粒，并且能夠有效的抑制FMDV在細(xì)胞內(nèi)的增殖。

慢病毒載體的宿主細(xì)胞廣泛、感染效率高、攜帶的目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞內(nèi)可以長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)、同時(shí)可以容納多個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和容納大片段的外源基因[24]。其作為一種理想的基因轉(zhuǎn)移工具，并應(yīng)用于一些科學(xué)領(lǐng)域的研究，例如慢病毒載體成為一個(gè)高效實(shí)用的基因轉(zhuǎn)移工具應(yīng)用于RNAi研究領(lǐng)域[25]。目前，慢病毒載體與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法相結(jié)合，被廣泛的用于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究[26]。本研究將干擾效果比較好的PLKO.1-VP1-2和PLKO.1-3D-1重組表達(dá)質(zhì)粒包裝成慢病毒，通過(guò)嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定的細(xì)胞系，然后用 ON FMDV 去感染篩選的細(xì)胞系，收集12、18、24 h的細(xì)胞毒液提取 RNA，做 RT-PCR 分析數(shù)據(jù)，結(jié)果表明含有慢病毒干擾載體組與陽(yáng)性對(duì)照相比其抑制率在88.3%～95.49%。本研究表明慢病毒制備成功，為后續(xù)抗口蹄疫病毒轉(zhuǎn)基因羊的生產(chǎn)培育奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

采用RNAi技術(shù)在細(xì)胞水平上篩選出能夠高效抑制ON 口蹄疫病毒復(fù)制的PLKO.1-VP1-2和PLKO.1-3D-1重組質(zhì)粒并成功制備慢病毒，為后續(xù)抗口蹄疫病毒轉(zhuǎn)基因羊的生產(chǎn)培育奠定了基礎(chǔ)。

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