汪燕秋，吳麗云，陳曉剛，孫 彤，李 沖，俞道進

(福建農林大學動物科學學院，福建省中西獸醫(yī)結合與動物保健重點實驗室，福州 350002)

沙門菌污染是一個全球關注的重要問題，對人類的威脅已超過數百年。據估計，全球每年發(fā)生的沙門菌感染病例超過9 000萬例，導致死亡人數達15.5萬人[1]。而中國發(fā)生的細菌性食物中毒中，有70%～80%致病菌是沙門菌[2]。在美國，沙門菌是導致食源性感染的第二大病原菌[3]。動物飼料作為沙門菌的重要傳染源受到廣泛關注[4]。動物飼料產業(yè)鏈中從原料生產開始各個階段均有較高沙門菌污染的風險。為控制飼料源致病菌的傳播，抗生素自1950年美國食品和藥品管理局(FDA)首次被批準用作飼料添加劑，半個多世紀以來一直被大量添加于養(yǎng)殖動物飼料中[5]。不可否認，抗生素對畜牧業(yè)起到十分積極的作用。但是，近年來，抗生素出現越來越多的負面效應，首當其沖就是耐藥菌株的不斷出現[6-7]，抗生素被逐步替代的呼聲越來越高。在2014年農業(yè)部2045號公告中，國家將甲酸、乙酸和檸檬酸等39種酸認定為安全的飼料添加劑品種，可應用于所有養(yǎng)殖動物飼料中，因此酸已成為替代抗生素的重要飼料添加劑組成部分[8]。

隨著酸的使用越來越廣泛，酸是否會如抗生素一樣出現越來越多的耐酸菌株，答案是肯定的。致病菌在應對酸性壓力環(huán)境時，為增加生存能力需要誘導酸耐受反應(acid tolerance response, ATR)。ATR是細菌在應對低pH值時產生的耐受[9-10]，研究表明沙門菌暴露在較高的酸性環(huán)境中時就會產生ATR[11]。同時，也有證據表明，ATR可能會增加細菌的毒力[12]，而細菌在不同生長階段的ATR具有不同特征[13-14]，在對數期和穩(wěn)定期產生不同反應，需要酸休克蛋白全程合成[15-16]。ATR還可以使細菌對熱、鹽、乙醇等壓力產生交叉耐受[17-18]。研究表明，沙門菌ATR可分為對數期ATR和穩(wěn)定期ATR，對數期ATR(LP ATR)可以進一步分為依賴于fur的短暫耐酸系統(tǒng)和僅依靠rpoS的更持久有效的ATR[19]。同樣，穩(wěn)定期的鼠傷寒沙門菌具有兩個獨立調節(jié)的穩(wěn)定期酸耐受系統(tǒng)。與pH無關的rpoS負責的酸耐受，以及依賴酸誘導的穩(wěn)定期ATR，與ompR相關[14]。本研究選取與對數期ATR相關的fur基因及與穩(wěn)定期ATR相關的ompR基因研究沙門菌的耐酸性。同時，N. Botteldoorn等[20-21]對比沙門菌rpoD、16S rRNA和gmK3個管家基因表達的穩(wěn)定性，結果表明，gmK是表達最穩(wěn)定的管家基因。因此，本研究采用實時熒光定量PCR技術，以gmK作為管家基因，選取與對數期ATR相關的fur基因及與穩(wěn)定期ATR相關的ompR基因研究沙門菌的耐酸性。并且，目前大部分對于ATR的研究是使用無機酸(如鹽酸)做酸化劑在30或37 ℃條件下進行[15, 22]，而在實際環(huán)境中，食源性致病菌更常暴露于20 ℃或者更低的溫度環(huán)境下以及弱有機酸(如乙酸)環(huán)境下。同樣，飼料的儲存條件一般也更常暴露于20 ℃或者更低的溫度環(huán)境下，并且隨著酸的使用越來越廣泛，飼料所帶的致病菌在酸性環(huán)境產生ATR在預測模型和風險評估方面，對微生物安全具有重要意義。

響應面分析法(response surface methodology, RSM)是設計試驗、建立模型和優(yōu)化條件的最有效的方法之一，受到幾個獨立變量的影響[23-25]。與傳統(tǒng)方法相比，響應面分析法不僅可以明確獨立變量對試驗的影響，確定最優(yōu)的試驗操作條件，而且可以有效的評估各變量之間的相互作用，以實現最佳的試驗性能[26-28]。因此，本研究旨在單因素試驗基礎上，采用響應面分析法創(chuàng)造最優(yōu)條件評估沙門菌在乙酸創(chuàng)造的酸性壓力條件下的行為，評價它們存活率的變化和參與酸耐受基因的轉錄變化。同時，將優(yōu)化后的模型應用于其他幾種常用有機酸上，以此驗證該模型對于其他幾種常用酸所創(chuàng)造的誘導模型效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 本試驗所用細菌為腸炎沙門菌ATCC13076(福建省出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心提供)。

1.1.2 試劑及溶液 腦心浸液肉湯(BHI)(廣東環(huán)凱生物科技有限公司)、冰乙酸(國藥集團化學試劑有限公司)、TE緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)、瓊脂糖凝膠(Biowest Agarose)、SUPER Green I核酸染料(PCR級)(北京泛博生物化學有限公司)、PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0)、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eras、Easy Dilutio、SYBR?Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)、DL1000 Marker、6×LoadingBuffer、RNAiso Plus(大連寶生物工程公司)、氯仿、無水乙醇、異丙醇(國藥集團化學試劑有限公司)、DEPC-treated water(上海生工生物工程公司)、5×TAE緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)。

1.1.3 設備 單人雙面超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)、離心機(Allegra X-22，Beckman Co μlter)、恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司)、超純水系統(tǒng)(MLli-Q)、電子天平(德國科恩ABT 320-4M)、PCR儀(美國 BIO-RAD Thermal Cycler型號：C1000)、電泳儀(北京六一儀器廠)、Real-time PCR系統(tǒng)(美國 BIO-RAD CFX96TMReal-time System)、凝膠成像系統(tǒng)(美國 BIO-RAD Gel Doc XR+molecular imager)。

1.2 方法

1.2.1 沙門菌的培養(yǎng) 取-80 ℃凍存沙門菌復活，培養(yǎng)24 h至穩(wěn)定期，取1 mL接種于100 mL BHI肉湯中培養(yǎng)得到菌液濃度約為104CFU·mL-1的菌懸液。

1.2.2 誘導產生酸耐受 將100 mL無菌BHI(pH=7)肉湯轉移到250 mL無菌錐形瓶中，加入菌液濃度約為104CFU·mL-1的活菌做兩個平行，用橡膠塞塞住后置于搖床中在細菌誘導溫度條件下、190 r·min-1適應20 h，此時細菌處于穩(wěn)定期階段。預先用乙酸將無菌BHI肉湯的pH值調整至4.0，再用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾，分裝到無菌試管中，每管裝3 mL肉湯，備用。將適應20 h后的細菌加入pH=4.0的BHI肉湯中，觀察細菌的生長狀況，應用MTT法[29]結合平板計數法檢測沙門菌活菌數。

1.2.3 單因素試驗 分別以細菌培養(yǎng)溫度(15、20、25、30、35、40 ℃)、母菌液添加量(1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%)、培養(yǎng)時間(3、4、5、6、7、8 h)作為影響因素，研究各單因素對細菌酸耐受情況的影響。

1.2.4 模型優(yōu)化前后酸性環(huán)境下細菌生存能力的變化 相關文獻報道的大部分酸耐受試驗都是在30或37 ℃下誘導酸耐受2 h，因此在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，本試驗將腸炎沙門菌暴露于乙酸處理的pH4.0環(huán)境下，測定細菌在30、37 ℃以及模型優(yōu)化后的溫度環(huán)境下細菌在2 h內生存能力的變化。

1.2.5 其他酸性壓力條件下模型優(yōu)化效果驗證 其他培養(yǎng)條件相同的情況下，在30、37 ℃條件下誘導酸耐受2 h，利用實時熒光定量PCR方法檢測模型優(yōu)化前后耐酸腸炎沙門菌耐酸基因轉錄情況，驗證模型優(yōu)化對酸耐受的影響。同時將此模型應用于甲酸、丙酸、正丁酸3種有機酸及無機酸磷酸環(huán)境下驗證此模型對其他幾種酸性壓力是否有效。

1.2.5.1 RNA提取及反轉錄：采用傳統(tǒng)法提取細菌RNA，并使用NANODROP超微量紫外分光光度計檢測RNA的濃度及純度。使用前用去核酸水對超微量紫外分光光度計進行清洗，用DEPC水進行校正調零。取1 μL RNA樣品點樣于超微量紫外分光光度計，直接讀數即可。選取OD260 nm/OD280 nm比值在1.8～2.0范圍內樣品進行下一步試驗。

在逆轉錄之前，先去除gDNA，以消除總RNA中gDNA的影響。分別加入5×gDNA Eraser Buffer，2.0 μL；gDNA Eraser，1.0 μL；RNA，5.0 μL；RNase Free ddH2O加至10 μL。反應條件：42 ℃金屬浴2 min或者室溫下孵育30 min。取上述反應液10 μL；加入PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL；RT Primer Mix 1.0 μL；5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time) 4.0 μL，RNase Free ddH2O 4.0 μL，總共20 μL，反應條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃保存，反應完成后，-20 ℃保存，用于下一步的試驗。

1.2.5.2 標準曲線的建立：熒光定量PCR的引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物

Table 1 Real-time fluorescence quantitative PCR primers

基因Gene方向Direction引物序列Primersequence產物長度/bpProductlengthgmK[26-27]ForwardprimerReserseprimer5'-TTGGCAGGGAGGCGTTT-3'5'-GCGCGAAGTGCCGTAGTAAT-3'101ompR[30]ForwardprimerReserseprimer5'-TGACCCGTGAATCTTTCCAT-3'5'-CCTTCGCCGTGACCATAA-3'126fur[31]ForwardprimerReserseprimer5'-ATGGGTGAAGAAATCGGTCT-3'5'-ATGGTCGTGATGATGCTGTT-3'135

以未做處理的標準菌cDNA作為標準曲線建立的標準品，對目的基因進行普通PCR擴增，反應結束后取5 μL PCR產物，點樣于10 g·L-1瓊脂糖凝膠孔中，120 V電泳20 min后，置于凝膠成像儀中觀察，并做好記錄。

用Easy Dilution對上述普通PCR的產物進行稀釋。取10個離心管，分別加入45 μL Easy Dilution，取5 μL 上述普通PCR產物加入第一個離心管，吹打混勻以后再取5 μL混合液加入第二個離心管中，以此類推，直至第10個離心管。取后8個離心管作為標準曲線的模板，然后對目的基因進行熒光定量PCR擴增，從而優(yōu)化熒光定量PCR反應的條件、獲得標準曲線。

1.2.5.3 耐酸基因相對轉錄水平檢測：采用實時熒光定量PCR技術，對耐酸基因ompR、fur進行檢測。根據SYBR?Premix ExTaqTM試劑盒說明書配制反應體系。以gmK基因作為內參基因，每個

樣品設定3個生物重復，每個生物重復做兩個技術重復。采用ΔΔCt法分析確定目的基因的相對轉錄水平。目的基因的相對轉錄水平= 2-ΔΔCt(式中ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因，ΔΔCt=ΔCt測試樣品-ΔCt校準樣品)。數據采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結 果

2.1 響應面試驗

2.1.1 單因素預試驗 分別以細菌培養(yǎng)溫度(15、20、25、30、35、40 ℃)、母菌液添加量(1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%)、培養(yǎng)時間(3、4、5、6、7、8 h)作為影響因素，研究各單因素對細菌酸耐受情況的影響，結果如圖1。試驗結果表明，本試驗所研究的所有變量均對細菌酸耐受產生影響，并且當培養(yǎng)溫度為20 ℃、母菌液添加量為10%、培養(yǎng)時間為6 h時，腸炎沙門菌對pH 4.0最容易產生耐受。

圖1 培養(yǎng)溫度、時間、母菌液添加量對沙門菌耐酸性的影響Fig.1 The influence of incubation temperature, incubation time and microbial amount on acid resistance of Salmonella

2.1.2 響應面試驗設計 在單因素預試驗結果的基礎上，確定響應面法的Box-Behnken設計來優(yōu)化和分析選定的因素：細菌培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、菌液添加量，分別記為A、B、C，在3個水平上進行優(yōu)化研究，以菌落數為響應值，記為Y，建立數學模型。響應面設計的因素與水平見表2，Box-Behnken設計的獨立變量和響應值見表3。

2.1.3 模型建立與方差分析 為了優(yōu)化3個獨立變量(細菌培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、菌液添加量)對酸性壓力條件下細菌菌落數的影響，采用3個因素和3個水平進行Box-Behnken設計，通過Design Expert 8.0軟件采用多元回歸分析對表3的數據進行分析，得出以菌落數(Y)為響應值，細菌培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、菌液添加量為變量真實值的二次多項式方程來描述酸性壓力條件下菌落數與變量之間關系：Y=0.39+0.018A+0.011B+0.013C-0.015AB+0.017AC-3.1×10-3BC-0.035A2-0.049B2-5.925×10-4C2，R2=0.953 7。模型的方差分析及失擬項見表4。

表2 響應面設計的因素與水平

Table 2 Variables and levels in response surface design

因素Factor因素標記Factorsign水平Level-101溫度/℃TemperatureA152025時間/hTimeB567菌液添加量/%AmountofbacteriaaddedC51015

表3 Box-Behnken設計的獨立變量和響應值

Table 3 Box-Behnken design with independent variables and response values

試驗編號Testnumber溫度/℃Temperature時間/hTime菌液添加量/%Amountofbacteriaadded菌落數/(109CFU·mL-1)Numberofcolonies1156150.34122206100.38143257100.32534207150.3510520750.34216205150.34127206100.38128256150.4001920550.319910155100.25351115650.339112206100.38511325650.329914206100.410015255100.329116206100.382117157100.3095

方差分析(ANOVA)用于分析模型方程的意義，其結果如表4所示。方差分析的兩個重要指標是F值和P值，模型F值為16.04，說明模型顯著，P<0.001同樣說明該模型是顯著，同時失擬項不顯著(P>0.05)。因此，培養(yǎng)溫度、菌液添加量、培養(yǎng)時間是酸性壓力條件下菌落數的重要影響因素。

2.1.4 酸性模型優(yōu)化 應用Design Expert 8.0 進行二次多項式模型擬合作圖，通過3D響應面圖和二維輪廓圖(圖2～4)反應3個變量及其交互作用對酸性壓力條件下菌落數的影響。

通過軟件分析，誘導腸炎沙門菌耐酸性的最佳條件：培養(yǎng)溫度22.49 ℃、培養(yǎng)時間6 h、菌液添加量15%。在此條件下，活菌菌落數達4.088×108CFU·mL-1。從二維圖可知，不同因素對誘導腸炎沙門菌耐酸性的影響大小順序為培養(yǎng)溫度>菌液添加量>培養(yǎng)時間。說明酸性壓力條件下，菌落數最依賴于培養(yǎng)溫度，其次是菌液添加量和培養(yǎng)時間。結合表4模型的方差分析以及圖2～4的三維圖可知，培養(yǎng)溫度和菌液添加量交互作用對酸性壓力條件下菌落數影響最大，其次是培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時間的交互作用，培養(yǎng)時間與菌液添加量交互作用對酸性壓力條件下菌落數影響最小，試驗結果表明細菌培養(yǎng)溫度和菌液添加量二者交互作用對誘導腸炎沙門菌耐酸性的影響最大。

表4 模型的方差分析及失擬項

Table 4 Analysis of variance (ANOVA) of the model and lack of fit

來源Source平方和Sumofsquare自由度Degreesoffreedom均方和MeansquareF值FvalueP值Pvalue模型Model0.02390.002516.040.0007A-溫度A-temperature0.002510.002515.740.0054B-時間B-time0.000910.00095.60.0498C-菌液添加量C-bacteriaaddeda-mount0.001310.001318.30.0236AB0.000910.00095.650.049AC0.001210.001167.330.0303BC0.0000410.000040.240.6371A20.005110.005132.230.0008B20.0110.0163.45<0.0001C20.000001510.00000150.00940.9257殘差Residual0.0011170.00016失擬項Miscalculationitem0.000530.000161.060.4594純誤差Pureerror0.0006240.00015總和Sum0.02416

圖2 細菌培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時間對沙門菌耐酸性的影響Fig.2 The influence of cultivate bacteria temperature and time on the acid resistance of Salmonella

圖3 細菌培養(yǎng)溫度與母菌液添加量對沙門菌耐酸性的影響Fig.3 The influence of cultivate bacteria temperature and microbial amount on the acid resistance of Salmonella

圖4 細菌培養(yǎng)時間與母菌液添加量對沙門菌耐酸性的影響Fig.4 The influence of cultivate bacteria time and microbial amount on the acid resistance of Salmonella

2.1.5 驗證試驗 采用“2.1.4”試驗中得到的最佳酸耐受誘導條件培養(yǎng)溫度22.49 ℃、培養(yǎng)時間6 h、菌液添加量15%進行誘導酸耐受重復試驗，考慮到實際操作的方便性，將最適培養(yǎng)溫度修正為22.5 ℃。按照修正后模型進行驗證試驗，設置3個平行試驗，優(yōu)化模型條件下耐酸細菌菌落數平均為0.396 6×109CFU·mL-1，符合度為97%。試驗結果與應用Design Expert 8.0 進行預測的結果接近，說明優(yōu)化模型適用于誘導腸炎沙門菌的耐酸性。

2.2 模型優(yōu)化對腸炎沙門菌生存能力的影響

由圖5可知，3種模型條件均對腸炎沙門菌的生存能力影響較大，首先，在pH4.0條件下，2 h的時間內，腸炎沙門菌的生存能力不斷下降，結合圖1可知，優(yōu)化溫度條件下，腸炎沙門菌生存能力下降最慢，并在適應酸之后，生存能力再緩慢回升。對比3種生長模型，可以推測，酸性壓力條件下，溫度越低，細菌生長能力越強，并在優(yōu)化溫度條件下達到最強，試驗結果表明，在溫度較低條件下，腸炎沙門菌適應酸的能力越強，37 ℃環(huán)境下，細菌適應酸能力最弱。

圖5 不同模型條件下腸炎沙門菌的生存能力Fig.5 Survival rates of Salmonella enteritidis under different model conditions

2.3 模型優(yōu)化對耐酸性基因轉錄水平的影響

2.3.1 PCR引物可行性驗證結果 3對引物經過PCR擴增以后，其產物凝膠電泳所獲得的條帶如圖6所示。ompR基因與fur基因擴增條帶大小與設計大小一致，將管家基因gmK的PCR擴增產物測序并與GenBank的序列(登錄號：AF140283)進行對比，保守區(qū)序列相似性為98.01%。

M. DL1000 DNA相對分子質量標準M. DL1000 DNA marker圖6 3對引物擴增基因的凝膠電泳結果Fig.6 Electrophoresis results of three genes

2.3.2 熒光定量PCR結果

2.3.2.1 標準曲線分析：熒光定量PCR擴增獲得的標準曲線顯示，3個目的基因的標準曲線擬合度(R2)均在0.99～1，擴增效率(E)均在98%～105%，其中兩個基因的標準曲線圖如圖7所示。

2.3.2.2 耐酸基因相對轉錄水平檢測結果：以未經過酸處理的沙門菌標準菌(加入等量PBS)作為空白組對照，3種處理方式對沙門菌耐酸基因的相對轉錄水平的影響如圖8所示。

圖7 gmK(A)、ompR(B)的標準曲線Fig.7 The standard curve of gmK(A), ompR(B)

*.P<0.05; **.P<0.01圖8 3種處理方式對沙門菌標準菌耐酸基因相對轉錄水平的影響Fig.8 Effect of three kinds of treatment methods on the Salmonella standard acid tolerance related genes

由圖8可知，優(yōu)化前的兩種方式對兩種酸耐受基因的相對轉錄量雖然產生影響，但是影響很小，模型優(yōu)化后耐酸基因fur的相對轉錄量是模型優(yōu)化前的1.4、1.12倍，ompR的相對轉錄量是模型優(yōu)化前的1.40、1.13倍，并且相互之間具有極顯著差異(P<0.01)，因此可以驗證模型優(yōu)化結果對乙酸耐受性產生最大影響。

2.3.2.3 優(yōu)化模型對其他酸性壓力環(huán)境下耐酸基因相對轉錄水平檢測結果: 由圖9可知，用甲酸、丙酸、正丁酸、磷酸調節(jié)培養(yǎng)基pH至4.0，菌液添加量一樣的條件下，相比優(yōu)化前大部分研究酸耐受文獻常用的在37 ℃環(huán)境下恒溫誘導酸耐受2 h，優(yōu)化后在22.5 ℃誘導6 h耐酸基因fur的相對轉錄都有極顯著提高(P<0.01)。轉錄量升高最為明顯的為丙酸壓力環(huán)境下，fur相對轉錄升高2.04倍。

*.P<0.05; **.P<0.01圖9 兩種酸誘導模型對fur基因相對轉錄水平的影響Fig.9 Effects of two acid-induced models on the relative expression of fur gene

由圖10可知，用甲酸、丙酸、正丁酸、磷酸調節(jié)培養(yǎng)基pH至4.0，在菌液添加量一樣的條件下，相比優(yōu)化前在37 ℃環(huán)境下恒溫誘導酸耐受2 h，優(yōu)化后在22.5 ℃誘導6 h耐酸基因ompR的相對轉錄同樣都有極顯著提高(P<0.01)。轉錄量升高最為明顯的同樣是丙酸壓力環(huán)境下，ompR相對轉錄升高2.42倍。

*.P<0.05; **.P<0.01圖10 兩種酸誘導模型對ompR基因相對轉錄水平的影響Fig.10 Effects of two acid-induced models on the relative expression of ompR gene

3 討 論

抗生素在為畜牧業(yè)做出巨大貢獻的同時，也因被濫用產生許多負面作用，因此，畜禽養(yǎng)殖各階段逐步應用酸替代抗生素，以期能控制致病菌的傳播[32]。而酸作為防腐劑的成分之一在食品工業(yè)中應用已有近百年歷史。研究表明，酸的使用可以有效減少一些食源性致病菌的生長，從而延長食品的保質期[33-34]。S. Bearson等[35]研究認為，酸性環(huán)境中的微生物可以感受到環(huán)境的惡化，合成特殊的應激蛋白。換而言之，在酸性環(huán)境中，不同的病原菌，以及一些進化后的新病原菌，都會逐漸適應酸性環(huán)境，并發(fā)展出在不同酸性環(huán)境中的不同生存方式[36]，這種適應酸應激的方式稱為酸耐受反應。A. Lianou等使用威布爾模型分析在葡萄糖存在條件下使用30種人或牛來源的不同血清型沙門菌研究沙門菌菌株誘導性酸耐受反應表型的變異性，結果表明這種酸耐受反應在不同菌株中存在較大的變異性[9]。P. S. Malheiros等也報道了在腸桿菌的適應性酸耐受反應中的菌株差異[37]。而目前對于沙門菌耐酸性的研究幾乎沒有選取腸炎沙門菌作為研究對象，據報道，在歐盟(EU)沙門菌是引起食源性疾病的首要原因，截至2013年，腸炎沙門菌與鼠傷寒沙門菌是從人類身上分離到的最常見的兩個血清型(分離率分別為39.5%和20.2%，N=73 627)[38-39]。腸炎沙門菌在臨床上具有重要地位，有必要對其酸耐受反應進行研究。本研究結果表明，經過乙酸處理，腸炎沙門菌酸耐受相關基因fur、ompR轉錄均極顯著升高，因此可知腸炎沙門菌能在酸性環(huán)境下適應酸并產生酸耐受反應。本研究將響應面法應用于腸炎沙門菌酸耐受條件的優(yōu)化，獲得較好的結果。通過條件優(yōu)化得出的最佳條件：培養(yǎng)溫度22.5 ℃、培養(yǎng)時間6 h、菌液添加量15%，細菌菌落數平均為3.966×108CFU·mL-1，與模型預測的提取率誤差較小，說明該條件參數是合理可靠的。

對比3種模型條件對腸炎沙門菌的生存能力影響，首先，在pH4.0條件下，2 h的時間內，腸炎沙門菌的生存能力不斷下降，同時，由試驗結果可知，溫度越低，腸炎沙門菌的生存能力下降越慢，優(yōu)化后的模型條件下，腸炎沙門菌的生存能力下降最慢，說明在溫度較低條件下，腸炎沙門菌適應酸的能力越強，37 ℃環(huán)境下，細菌適應酸能力最弱。經過酸處理后耐酸菌的fur和ompR相對轉錄均升高，相比已報道的常用于研究誘導酸耐受模型[10,13,17]，應用優(yōu)化后的誘導酸耐受模型進行誘導后酸耐受相關基因fur和ompR的相對轉錄極顯著升高(P<0.01)。換而言之，在優(yōu)化后的誘導酸耐受模型條件下腸炎沙門菌更易產生耐酸性。同時，本研究還將此模型應用于其他常用酸甲酸、丙酸、正丁酸和磷酸誘導的酸耐受模型上，對比37 ℃環(huán)境下誘導酸耐受對fur和ompR基因相對轉錄的影響，結果同樣驗證了該模型更易誘導腸炎沙門菌產生耐酸性，提高腸炎沙門菌耐酸基因的相對轉錄。

4 結 論

成功建立腸炎沙門菌耐酸模型：培養(yǎng)溫度22.5 ℃、培養(yǎng)時間6 h、菌液添加量15%，在此模型下，與已報道常用于進行誘導酸耐受的2種模型進行對比，優(yōu)化模型條件下，腸炎沙門菌的生存能力下降最慢，說明在溫度較低條件下，腸炎沙門菌適應酸的能力越強。同時應用實時熒光定量PCR方法測定耐酸基因fur和ompR相對轉錄的變化驗證模型優(yōu)化結果，驗證了該方法能合理地優(yōu)化細菌酸耐受誘導條件，并且，該方法對其他酸性壓力條件下誘導的酸耐受同樣有效。

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