新型雙功能席夫堿熒光探針分別識(shí)別檢測(cè)Zn2+和CN-

董振明 王佳娜 張 強(qiáng) 王 煜

(山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 太原 030000)

1 引 言

生物樣品及環(huán)境中陰陽離子的識(shí)別與檢測(cè)是目前化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在眾多檢測(cè)方法中，熒光傳感器由于具有選擇性好、靈敏度高、操作簡單和可實(shí)時(shí)在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[1]。 Zn是人體中含量僅次于鐵的過渡金屬，是人體必需的微量元素之一。在基因表達(dá)、神經(jīng)信號(hào)傳輸、金屬酶的調(diào)節(jié)、DNA結(jié)合或識(shí)別等多種生物學(xué)活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。Zn2+代謝失衡會(huì)導(dǎo)致缺氧缺血、癲癇及各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如老年癡呆癥、帕金森病等。此外，過量的Zn2+會(huì)使土壤微生物的活性降低，對(duì)植物造成不良影響。因此，對(duì)環(huán)境及生物系統(tǒng)中Zn2+的檢測(cè)具有十分重要的意義[2]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的Zn2+熒光傳感器很多[3～12]，但仍然存在合成復(fù)雜、選擇性和靈敏度不理想等不足。Hagimori等[4]合成了可在水相體系中檢測(cè)Zn2+的熒光探針，但不能消除Cd2+對(duì)檢測(cè)的干擾，選擇性有待提高。Lee等[8]設(shè)計(jì)的席夫堿探針合成方法較簡單，但只能在純乙腈中檢測(cè)Zn2+，且靈敏度不高。因此，開發(fā)合成方法簡單、選擇性好、靈敏度高的Zn2+傳感器，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

UV-2450分光光度計(jì)(日本島津公司); LS-55熒光光度計(jì)(美國Perkin-Elmer公司)，激發(fā)波長分別為328 nm (Zn2+)和335 nm (CN-); PicoMaster 1000-TCSPC 熒光分光光度計(jì)(美國PTI公司); 雷磁pHS-3C 酸度計(jì)(上海精密儀器公司); DRX-600核磁共振儀(瑞士F?llenden公司); TENSOR Ⅱ紅外光譜儀(德國Bruker公司); Thermo Scientific Q Exactive 質(zhì)譜儀(美國Thermo Scientific公司); LSM 880 with Airyscan 激光掃描共聚焦顯微鏡(德國卡爾蔡司公司)。

4'-羥基-4-氰基聯(lián)苯(95%，北京百靈威科技有限公司); 2-氨甲基吡啶(97%，上海韶遠(yuǎn)化學(xué)科技有限公司); 其它試劑均為分析純。金屬離子儲(chǔ)備液均為其相應(yīng)的硝酸鹽或氯化物水溶液(1.0×10-2mol/L); 陰離子儲(chǔ)備液均為其相應(yīng)的鉀鹽或鈉鹽水溶液(1.0×10-2mol/L); 探針儲(chǔ)備液濃度為1.0×10-3mol/L。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2 探針HPBC的合成

3'-甲?；?4'-羥基-4-氰基聯(lián)苯根據(jù)文獻(xiàn)[23]的方法合成，如Scheme 1所示，得到白色的固體產(chǎn)物。1H NMR (DMSO-d6)δ(ppm): 11.05 (s, 1H, OH), 10.33(s, 1H, CHO), 8.02 (s, 1H, ArH), 7.95 (d, 1H, ArH), 7.91 (d, 2H, ArH), 7.86 (d, 2H, ArH), 7.15 (d, 1H, ArH)。

Scheme 1 HPBC的合成路線Scheme 1 Synthesis of 4'-hydroxy-3'-((2-pyridin-2-ylmethylimino) methyl)-4-biphenyl carbonitrile (HPBC)

2.3 紫外和熒光光譜實(shí)驗(yàn)

紫外吸收光譜實(shí)驗(yàn)中，HPBC濃度均為40 μmol/L; 熒光光譜實(shí)驗(yàn)中，HPBC濃度均為4 μmol/L。探針HPBC檢測(cè)Zn2+的光譜實(shí)驗(yàn)均在 乙醇-H2O(2∶3，V/V, HEPES, pH=7.4)體系中進(jìn)行; 檢測(cè)CN-的光譜實(shí)驗(yàn)均在DMSO-H2O(3∶7，V/V)體系中進(jìn)行。在比色管中配制5 mL一定濃度的HPBC溶液，然后向其中滴加離子溶液進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)。以硫酸奎寧(ΦF=0.54)為標(biāo)準(zhǔn)參照物，分別測(cè)定HPBC中加入Zn2+和CN-前后的熒光量子產(chǎn)率。

2.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

利用肝癌細(xì)胞BEL-7402進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。在37℃，含5% CO2的環(huán)境條件下，將細(xì)胞置于10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培育。向含有細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)基中加入3.0×10-5mol/L探針HPBC溶液，孵育30 min后，用細(xì)胞培養(yǎng)液清洗細(xì)胞。在激發(fā)波長405 nm、40×物鏡的激光共聚焦顯微鏡下，觀察HPBC的細(xì)胞熒光成像圖。繼續(xù)加入1.5×10-4mol/L Zn2+溶液，在相同條件下孵育，清洗后，觀察HPBC+Zn2+的細(xì)胞熒光成像圖。

2.5 CN-試紙條的制備和CN-檢測(cè)

將濾紙浸泡在1.0 mmol/L HPBC的DMSO溶液中，一段時(shí)間后取出晾干，制成試紙條。隨后將浸有HPBC的試紙條分別浸泡在不同濃度的CN-的溶液中，在自然光和紫外燈下觀察試紙條的變化。

3 結(jié)果與討論

3.1 探針HPBC對(duì)Zn2+的識(shí)別檢測(cè)

3.1.1Zn2+對(duì)HPBC光譜的影響在EtOH-H2O(2∶3，V/V, HEPES, pH=7.4)體系中測(cè)定了Zn2+對(duì)HPBC的紫外-可見吸收光譜及熒光光譜的影響。如圖1A所示，HPBC在283 和413 nm處分別有較強(qiáng)和較弱的兩個(gè)吸收峰，并在328 nm處存在較寬的肩峰。隨著Zn2+的加入，位于283和413 nm處的吸收峰逐漸降低，而在328 nm處的吸收峰顯著增強(qiáng)，同時(shí)在277、305和404 nm處出現(xiàn)等吸收點(diǎn)。吸收峰的變化可能是由于探針分子中的酚O原子與Zn2+結(jié)合，使分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)(ICT)發(fā)生變化所致。當(dāng)Zn2+濃度與探針濃度相同時(shí)，328 nm處的吸收趨于穩(wěn)定并達(dá)到最大，說明HPBC與Zn2+形成了1∶1的絡(luò)合物。

圖1 在EtOH-H2O(2∶3 V/V, HEPES, pH=7.4)體系中，(A) HPBC(40 μmol/L)的紫外吸收光譜隨Zn2+ (0～1 equiv.)濃度的變化，插圖為HPBC在328 nm處的吸收強(qiáng)度隨Zn2+濃度的變化; (B) HPBC(4.0 μmol/L)的熒光光譜隨Zn2+ (0～5 equiv.)濃度的變化，插圖為HPBC在465 nm處的熒光強(qiáng)度隨Zn2+濃度的變化及用365 nm的紫外燈下激發(fā)，HPBC在加入Zn2+前后的熒光改變。Fig.1 (A) Absorption spectra of HPBC (40 μmol/L) in the presence of Zn2+ (up to 1 equiv.). Inset is plot of changes in absorption intensity at 328 nm with increase of Zn2+ concentration. (B) Fluorescence titration of HPBC (4.0 μmol/L) with different concentrations of Zn2+ (0-5 equiv.) in EtOH-H2O (2∶3, V/V, HEPES, pH 7.4). Inset is changes of emission intensity at 465 nm and change in color of HPBC observed under a 365 nm UV lamp following addition of Zn2+.

圖2 297 nm的LED燈激發(fā)下，(a) HPBC(4.0 μmol/L)和(b) HPBC(4.0 μmol/L)-Zn2+(8.0 μmol/L)的熒光衰減曲線Fig.2 Fluorescence decay curves of (a) HPBC (4.0 μmol/L) and (b) HPBC(4.0 μmol/L)-Zn2+(8.0 μmol/L) obtained under a light emitting diode Lamp of 297 nm

3.1.2HPBC對(duì)Zn2+的熒光測(cè)定考察了pH值對(duì)HPBC和HPBC-Zn光譜的影響， 結(jié)果表明，HPBC-Zn的熒光對(duì)pH值有很強(qiáng)的依賴性。在pH 7～9范圍內(nèi)，熒光信號(hào)趨于穩(wěn)定(見電子版文后支持信息圖S1)。這為實(shí)現(xiàn)生物檢測(cè)提供了可能性。實(shí)驗(yàn)選擇pH=7.4的HEPES緩沖溶液調(diào)節(jié)測(cè)定體系的pH值。

考察了HPBC檢測(cè)Zn2+的選擇性。如圖3A所示，當(dāng)HPBC中加入常見金屬離子K+、 Ca2+、 Na+、 Mg2+、 Al3+、 Hg2+、 Ag+、 Pb2+、 Cd2+、 Cr3+、 Fe3+、 Ni2+、 Co2+、 Cu2+、Zn2+后，只有Zn2+使探針熒光顯著增強(qiáng)，表明HPBC可以選擇性識(shí)別Zn2+。為了探究HPBC 對(duì)Zn2+的實(shí)際檢測(cè)能力，考察了在其它金屬離子共存的條件下，Zn2+對(duì)HPBC熒光強(qiáng)度的影響。如圖3B所示，除Co2+、Cu2+可猝滅體系的熒光外，其它金屬離子的存在均不會(huì)對(duì)HPBC-Zn2+熒光發(fā)射強(qiáng)度產(chǎn)生明顯影響。進(jìn)一步考察了Zn2+分別與Co2+、Cu2+共存時(shí)HPBC的紫外光譜變化(見電子版文后支持信息圖S2)，結(jié)果表明，這兩種離子共存時(shí)，HPBC中的N、O原子會(huì)競(jìng)爭性絡(luò)合Co2+和Cu2+[26]，而這兩種離子具有順磁性，可能與配體之間發(fā)生電子或能量轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致HPBC熒光猝滅。

圖3 (A) HPBC (4.0 μmol/L)對(duì)金屬離子(8.0 μmol/L)的選擇性; (B) Zn2+(8.0 μmol/L)與其它金屬離子(8.0 μmol/L)共存時(shí)，HPBC (4.0 μmol/L)在468 nm處的熒光強(qiáng)度Fig.3 (A) Emission spectra of HPBC (4.0 μmol/L) in the presence of various metal ions (8.0 μmol/L). (B) Fluorescence intensities of HPBC (4.0 μmol/L) at 468 nm upon addition of Zn2+ (8.0 μmol/L) in the presence of interfering metal ions (8.0 μmol/L)

測(cè)定了HPBC對(duì)Zn2+的熒光滴定曲線。圖1B插圖表明，體系在468 nm處的熒光強(qiáng)度與Zn2+濃度在0.4～4.0 μmol/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系(R2=0.9978)，檢出限為36.5 nmol/L(3σ/S)，低于國標(biāo)GB 5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的飲水中Zn2+含量的限量值1.0 mg/L(約15 μmol/L)[14]，比WHO規(guī)定飲用水中Zn2+限量水平(76 μmol/L)低約1000倍[27]。將HPBC與文獻(xiàn)報(bào)道的席夫堿型Zn2+熒光探針進(jìn)行比較(見電子版文后支持信息表S1)，結(jié)果表明，本研究中探針HPBC的合成方法簡單，可以高效識(shí)別檢測(cè)水體系中的Zn2+，具有較高的靈敏度。

圖4 向HPBC中交替加入Zn2+與EDTA的熒光變化。[HPBC]=4.0 μmol/L, [Zn2+]=8.0 μmol/L, [EDTA]=8.0 μmol/L。插圖為紫外燈下相應(yīng)熒光變化。Fig.4 Fluorescence intensity changes of HPBC upon alternate addition of Zn2+ and EDTA, [HPBC]=4.0 μmol/L, [Zn2+]=8.0 μmol/L, [EDTA]=8.0 μmol/L. Inset shows the corresponding visual fluorescent color changes

采用乙二胺四乙酸二鈉鹽(Na2EDTA)研究了HPBC檢測(cè)Zn2+的可逆性。向HPBC中交替加入Zn2+和EDTA，HPBC表現(xiàn)出“ON-OFF-ON”模式的熒光變化(圖4)，且在4次循環(huán)后，體系熒光效率損失較小，表明HPBC對(duì)Zn2+的識(shí)別檢測(cè)具有良好的可逆性。

3.1.3HPBC與Zn2+的結(jié)合模式采用熒光等摩爾連續(xù)變化法(電子版文后支持信息圖S3A)測(cè)定，顯示HPBC與Zn2+的絡(luò)合比為1∶1。根據(jù)熒光滴定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(電子版文后支持信息圖S3B)，利用Benesi-Hildebrand方程計(jì)算得出HPBC與Zn2+的結(jié)合常數(shù)為2.75×104L/mol，高分辨質(zhì)譜分析進(jìn)一步證明了此結(jié)論。圖5質(zhì)譜圖中峰m/z407.79179為HPBC-H++Zn2++CH3OH(計(jì)算值：m/z408.06904)。

圖5 HPBC-Zn2+的高分辨質(zhì)譜Fig.5 Mass spectra of HPBC in the presence of Zn2+

圖6 探針HPBC與Zn2+核磁滴定圖及其結(jié)合模式圖Fig.6 Partial 1H NMR spectra of HPBC in the presence of different concentrations of Zn2+ (NO3)2·6H2O in d6-DMSO

3.1.4細(xì)胞熒光成像利用熒光共聚焦顯微鏡考察了HPBC與Zn2+在肝癌細(xì)胞(BEL-7402)中的成像。如圖7所示，細(xì)胞與HPBC(30 μmol/L)共培養(yǎng)30 min后，不發(fā)射熒光。當(dāng)HPBC預(yù)處理過的BEL-7402細(xì)胞與Zn2+(0.15 mmol/L)培養(yǎng)30 min后，細(xì)胞發(fā)射強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，表明HPBC可以有效地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的Zn2+。

圖7 BEL-7402細(xì)胞熒光成像圖：(A) 細(xì)胞與HPBC(30 μmol/L)共同孵育30 min; (B) HPBC (30 μmol/L)與細(xì)胞孵育后，再與Zn2+(0.15 mmol/L)共孵育30 min。(1)明場(chǎng)成像;(2)暗場(chǎng)成像;(3)疊加成像Fig.7 Fluorescence images of BEL-7402 cells treated with HPBC and Zn2+. (A) cell incubated with HPBC (30 μmol/L) for 30 min. (B) cell pre-incubated with HPBC (30 μmol/L) for 30 min and then treated with 0.15 mmol/L Zn2+. (1) Bright field image; (2) fluorescence image and (3) merged image

3.2 探針 HPBC對(duì)CN-的識(shí)別檢測(cè)

3.2.1HPBC對(duì)CN-的傳感識(shí)別考察了DMSO-H2O溶劑中陰離子對(duì)HPBC光譜的影響。發(fā)現(xiàn)探針對(duì)陰離子的光譜響應(yīng)與DMSO-H2O中水的含量有關(guān)，最終選擇了與其它陰離子相比對(duì)CN-有很好選擇性的DMSO-H2O(3∶7,V/V)作為測(cè)定溶劑。

探針的紫外-可見吸收光譜在257、288、335和395 nm處有4個(gè)吸收峰(圖8A)。當(dāng)向探針HPBC中逐量加入CN-時(shí)，HPBC在257和288 nm處的吸收峰逐漸減弱，而在335及395 nm處的吸收峰增強(qiáng)，溶液顏色由無色變?yōu)榈S色，同時(shí)在307 nm處產(chǎn)生一個(gè)等吸收點(diǎn)，表明生成了一個(gè)穩(wěn)定的新物種。

如圖8B所示， 激發(fā)波長為335 nm時(shí)，由于探針分子存在ESIPT效應(yīng)，HPBC(ΦF=0.05)在510 nm處熒光很弱。逐漸加入CN-后，體系在510 nm的綠色熒光增強(qiáng)(ΦF=0.18)。熒光的增強(qiáng)可能是由于CN-使HPBC中的酚羥基去質(zhì)子化，抑制了ESIPT效應(yīng)。同樣測(cè)定了體系在加入CN-前后熒光壽命的變化(電子版文后支持信息圖S4)。在DMSO-H2O(3∶7,V/V)體系中，在297 nm激發(fā)波長下， 測(cè)得HPBC的平均熒光壽命為0.36 ns，當(dāng)與CN-作用后，熒光壽命為2.12 ns。計(jì)算得到HPBC的kr=1.39×108s-1，knr=2.64×109s-1。而加入CN-后的kr=8.49×107s-1，knr=3.87×108s-1，表明當(dāng)探針中加入CN-，kr/knr比值增大，因而熒光增強(qiáng)。

圖8 DMSO-H2O (3∶7, V/V)中(A) HPBC (40 μmol/L)紫外吸收光譜隨CN-濃度(0～10 equiv.)的變化; (B) HPBC(4.0 μmol/L)熒光光譜隨CN- (0～40 equiv.)濃度的變化Fig.8 (A) Absorption titration of HPBC (40 μmol/L) with different concentrations of CN- (0-10 equiv.) in DMSO-H2O (3∶7, V/V). Inset shows color change of HPBC in the presence of CN-. (B) Fluorescent spectra of HPBC (4.0 μmol/L) in the presence of CN- (0-40 equiv.). Inset shows emission intensity at 510 nm upon addition of different amount of CN- and change in color of HPBC observed under a UV lamp following addition of CN-

圖9 (A) HPBC(4.0 μmol/L)對(duì)陰離子(80 μmol/L)的熒光選擇性，(B) CN-(80 μmol/L)與其它陰離子(80 μmol/L)共存時(shí)，HPBC(4.0 μmol/L)的熒光強(qiáng)度Fig.9 (A) Fluorescence spectra of HPBC(4.0 μmol/L) respectively upon addition of several anions(80 μmol/L). (B) Fluorescence intensities of HPBC(4.0 μmol/L) in the presence of CN-(8.0 μmol/L) with other anions(80 μmol/L).

圖10 探針HPBC與KCN核磁滴定圖Fig.10 Partial 1H NMR spectra of HPBC in the presence of different concentrations of KCN in d6-DMSO

表1 自來水樣品中CN-的檢測(cè)

Table 1 Determination of CN-in tape water samples

樣品Samples加入量Added(μmol/L)檢測(cè)含量Found(μmol/L)回收率Recovery(%)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%，n=5)10---21．501．58105．01．4538．008．18102．00．94424．023．798．91．84

3.2.2實(shí)際樣品中CN-的分析采用HPBC對(duì)飲用水中的CN-進(jìn)行了測(cè)定， 加標(biāo)回收率為98.9%～105.0%(表1)， 表明本方法可用于實(shí)際水樣中CN-的檢測(cè)。

將HPBC制作成試紙條，用于CN-的傳感識(shí)別。利用HPBC的試紙條檢測(cè)水樣中的CN-，結(jié)果如圖11所示，可以觀察到較明顯的顏色及熒光變化。因此，探針HPBC能夠通過試紙條的方式方便快捷地檢測(cè)CN-。

圖11 自然光(A)和紫外燈(365 nm)(B)下試紙條對(duì)不同濃度CN-的檢測(cè)結(jié)果Fig.11 HPBC-based test strips upon addition of CN- under (A) natural light and (B)365 nm UV lamp

4 結(jié) 論

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