李夢尋， 胡九英， 孫敬禮， 魯慧文， 汪德明， 王 忻， 劉 乙， 馬力鵬， 李 濤， 沈永巧， 來紅霞， 黃 濤

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000； 2.新疆正大食品有限公司，新疆五家渠 831301)

豬的繁殖性能是重要經(jīng)濟(jì)性狀，但遺傳力低，利用常規(guī)育種對(duì)該性狀進(jìn)行遺傳改良進(jìn)展緩慢。利用影響產(chǎn)仔性能的主效基因進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種是加快母豬繁殖性狀遺傳進(jìn)展的有效途徑。

FSH-β是促卵泡素β基因。促卵泡素(FSH)是哺乳動(dòng)物卵子和精子成熟的主要刺激物，是α/β異二聚體糖蛋白激素家族的成員。α和β二亞基非共價(jià)連接，β亞基決定著每種激素的生理特征[1]。FSH能誘導(dǎo)雌性動(dòng)物的卵泡發(fā)育、促進(jìn)子宮內(nèi)膜生長等，F(xiàn)SH還協(xié)同促黃體生成素(LH)一起刺激性腺類固醇、雌二醇和孕酮的合成和分泌，而這些固醇類物質(zhì)又可以直接或間接地調(diào)控FSH的合成[2]。FSH在畜牧業(yè)生產(chǎn)中用于家畜的同期發(fā)情和超數(shù)排卵等[3]。有研究認(rèn)為FSH-β基因可作為遺傳學(xué)中有關(guān)繁殖性狀研究的重要分子標(biāo)記，基因中的1處逆轉(zhuǎn)座子插入突變產(chǎn)生AA、AB、BB 3種基因型[4]。

催乳素受體(PRLR)是細(xì)胞分裂素受體超家族，是一個(gè)單獨(dú)的膜被蛋白[5]。PRLR的缺失會(huì)影響催乳素蛋白的作用，使催乳素不能與之結(jié)合，進(jìn)而不能通過受體作用于靶細(xì)胞而引起靶基因的表達(dá)。PRLR基因的突變可以提高窩產(chǎn)子數(shù)和窩產(chǎn)活子數(shù)，降低木乃伊率，PRLR基因的敲除會(huì)引起動(dòng)物的繁殖障礙疾病[6]。目前，PRLR基因的作用引起了豬育種研究者的重視，并把它作為繁殖性狀的候選基因之一。

FUT1基因位于6號(hào)染色體上，是編碼α-(1，2)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶的基因，多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)其與豬腹瀉有關(guān)，但近年來也有研究證明FUT1與母豬繁殖性狀有關(guān)。

母豬繁殖性狀是數(shù)量性狀，遺傳力低。遺傳、季節(jié)、胎次和周圍環(huán)境等因素都能對(duì)其造成影響。FSH-β、PRLR和FUT1基因與豬繁殖性能有密切關(guān)聯(lián)，但由于試驗(yàn)群體和樣本量不同，研究結(jié)果各有差異。此外多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，單個(gè)候選基因的優(yōu)勢等位基因和基因型對(duì)母豬繁殖性狀的影響不顯著，而多個(gè)候選基因合并基因型對(duì)母豬繁殖性狀的影響有顯著差異。本研究檢測了大白豬FSH-β、PRLR和FUT1基因多態(tài)性，并分析其單個(gè)基因的基因型和合并基因型與豬繁殖性狀之間的關(guān)系，以便為大白豬分子標(biāo)記輔助選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所選用的269頭大白母豬均來自新疆正大種豬場。采集耳組織樣本，放入含1 mL 75%乙醇的Eppendoff管內(nèi)，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃保存，以備后面的樣本組織DNA提取。此外搜集整理了樣本群體第二胎的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、健子數(shù)、窩質(zhì)量、初生體質(zhì)量、死胎、木乃伊、弱仔和畸形等繁殖性狀相關(guān)資料。

1.2 試驗(yàn)試劑

2×EsTaqMaster Mix，購自CWBIO公司；Marker DL2000、血液、細(xì)胞、組織基因組DNA抽提試劑盒，均購自TIANGEN公司；限制性內(nèi)切酶AluⅠ、HhaⅠ，購自TaKaRa公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

FSH-β、PRLR和FUT1基因PCR擴(kuò)增引物參照施啟順等的引物序列[7-8]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息

1.4 豬耳組織DNA提取

用血液、細(xì)胞、組織基因組DNA抽提試劑盒對(duì)所采集母豬耳組織樣進(jìn)行基因組DNA提取并檢測其濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR擴(kuò)增與多態(tài)性檢測

1.5.1 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系15.0 μL：2×EsTaqMaster Mix 7.5 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板DNA 0.5 μL，去離子水6.2 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性4 min，35次循環(huán)(94 ℃，30 s；56、60、57 ℃，30 s；72 ℃，30 s)，72 ℃延伸 5 min。所有基因PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠檢測后方可進(jìn)行下一步反應(yīng)。

1.5.2 基因型檢測FSH-β基因由片段插入造成，2.0%瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物即可見多態(tài)性。PRLR基因酶切反應(yīng)：13.0 μL PCR產(chǎn)物、0.5 μL AluⅠ及1.5 μL Buffer，37 ℃水浴4 h，反應(yīng)結(jié)束后取酶切產(chǎn)物10.0 μL用4.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測分型。FUT1基因酶切反應(yīng)：8.5 μL PCR產(chǎn)物、0.5 μL HhaⅠ和1.0 μL Buffer，37 ℃水浴3 h，酶切產(chǎn)物 10 μL 用2.0%的瓊脂糖電泳檢測分型。

1.6 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析

用Excel表格計(jì)算基因頻率、基因型頻率、多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)、群體雜合度，并對(duì)基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)[9]，用SPSS 17.0分析總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、健仔數(shù)等繁殖性狀在不同基因型之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增及酶切結(jié)果

FSH-β基因由片段插入得到，瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物即可見多態(tài)性，PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)生3種帶型：500 bp純合子(AA基因型)；500、220 bp雜合子(AB基因型)；220 bp純合子(BB基因型)。

PRLR基因PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶AluⅠ酶切后，產(chǎn)生3種帶型：85、59、19 bp的命名為AA基因型；104、85、59、19 bp 的命名為AB基因型；104、59 bp的命名為BB基因型。

FUT1基因PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶HhaⅠ酶切后經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測到3種帶型：328、93 bp的命名為AA基因型；328、241、93、87 bp的命名為AB基因型；241、93、87 bp的命名為BB基因型。

2.2 各基因型頻率、基因頻率及群體遺傳特性

2.2.1 各基因型頻率、基因頻率 由表2可知，F(xiàn)SH-β基因型頻率在大白豬為AB>BB>AA，優(yōu)勢基因均為B等位基因優(yōu)勢。PRLR基因型頻率在大白豬為AB>AA>BB，優(yōu)勢基因均為A基因。FUT1基因型頻率在大白豬為BB>AB>AA，優(yōu)勢基因均為B基因。

表2 FSH-β、PRLR和FUT1基因的基因型頻率及等位基因頻率

2.2.2 不同基因的群體遺傳特性 由表3可知，F(xiàn)SH-β、PRLR和FUT1基因在試驗(yàn)群體中具有中度多態(tài)(0.25

表3 基因多態(tài)信息含量(PIC)、雜合度(H)、有效等位基因數(shù)(Ne)及χ2檢驗(yàn)

注：df=2，P=0.05時(shí)χ2=5.99，P=0.01時(shí)χ2=9.21。

2.3 基因多態(tài)性與豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.3.1 單個(gè)基因多態(tài)性與豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析FSH-β基因各基因型間母豬繁殖性狀上均無顯著差異，因此表中并未列出。由表4可知，對(duì)于PRLR基因，AA、AB型個(gè)體總產(chǎn)仔數(shù)分別比BB型個(gè)體高出2.07頭/胎(P<0.05)和1.30頭/胎(P<0.05)，各基因型間其他繁殖性狀上均無顯著差異。對(duì)于FUT1基因，AA型個(gè)體弱仔數(shù)分別比BB、AB型少1.24頭/胎(P<0.05)和1.02頭/胎(P<0.05)，AA型個(gè)體畸形胎兒數(shù)比AB、BB型個(gè)體高0.72頭/胎(P<0.01)和0.71頭/胎(P<0.01)，其他繁殖性狀上各基因型間均無顯著差異。

2.3.2 合并基因型與豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.3.2.1FSH-β與PRLR合并基因型與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析 由表5可知，在總產(chǎn)仔數(shù)、總活仔數(shù)性狀上FSH-β—PRLR合并基因AAAA型個(gè)體比AABB型高出4.6頭/胎(P<0.01)和3.9頭/胎(P<0.01)；在窩質(zhì)量性狀上，AAAA型個(gè)體高于AABB型5.4 kg/胎(P<0.05)。因此，在大白豬中FSH-β-PRLR最優(yōu)分子標(biāo)記組合為AAAA。

表4 PRLR和FUT1基因多態(tài)性與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

注：同列小寫字母、大寫字母不同者分別為差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。下表同。

表5 FSH-β和PRLR合并基因型與大白豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

聯(lián)分析 由表6可知，在大白豬中FSH-β—FUT1的ABAB型個(gè)體木乃伊胎數(shù)量比BBBB型多0.28頭/胎(P<0.05)；在子代畸形數(shù)量上BBAA型個(gè)體多于其他基因型(P<0.01)；在其他繁殖性狀上各基因型間均無顯著差異。

表6 FSH-β和FUT1合并基因型與大白豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.3.2.3PRLR與FUT1合并基因型與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析 由表7可知，在大白豬中，PRLR—FUT1合并基因型BBAB型個(gè)體木乃伊胎數(shù)量多于其他各基因型(P<0.01)，ABAA、BBBB型低于AAAB、AABB、ABAB、ABBB型(P<0.01)；在其他繁殖性狀上各基因型間均無顯著差異。

表7 PRLR和FUT1合并基因型與大白豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.3.2.4FSH-β、PRLR與FUT1合并基因型與母豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析 由表8可知，在大白豬中由于FSH-β—PRLR—FUT1中AAAAAB和AABBAB型個(gè)體的數(shù)量少于3頭，因此這2種基因型不參與多重比較。FSH-β—PRLR—FUT1 BBAABB型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)和活仔數(shù)分別比BBABAB型多3.20頭(P<0.01)、2.98頭(P<0.05)。因此，在大白豬中FSH-β—PRLR—FUT1最優(yōu)分子標(biāo)記組合為BBAABB。

3 結(jié)果與討論

FSH-β是母豬繁殖性狀的一個(gè)主效基因。研究表明B等位基因?yàn)閮?yōu)勢基因，初產(chǎn)母豬FSH-β基因的AB基因型健仔數(shù)比AA型多1.21頭(P<0.01)，經(jīng)產(chǎn)母豬各基因型之間產(chǎn)仔數(shù)差異不顯著[9]。在趙要風(fēng)等的研究中，杜洛克、大約克、長白等國外豬種中BB型為FSH-β的優(yōu)良基因型，AA型比較罕見[10]。而Korwin-Kossakowska等研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH-β對(duì)產(chǎn)仔數(shù)的提高無顯著影響[11-12]。本研究所用經(jīng)產(chǎn)大白豬群體優(yōu)勢基因均為B等位基因，優(yōu)良基因型為BB型，F(xiàn)SH-β的不同基因型對(duì)不同繁殖性狀的影響均不顯著，這表明單個(gè)基因FSH-β對(duì)經(jīng)產(chǎn)母豬的繁殖性狀的選擇不具有顯著意義。

PRLR也是母豬繁殖性狀的主效基因之一，由腺垂體分泌，含有膜外結(jié)構(gòu)域、跨膜域和胞內(nèi)域3個(gè)部分，胞內(nèi)域的變異導(dǎo)致了受體結(jié)構(gòu)的多樣性[13-14]。王立辛等報(bào)道了PRLR基因在長白、大白和杜洛克群中基因頻率及基因型頻率情況，長白群中AB的基因型頻率最高，杜洛克群中AA的基因型頻率最高，A等位基因在各種群中占主導(dǎo)地位[15]。Isler等研究，PRLR基因?qū)A、AB和BB型的母豬的子宮角胎兒的平均數(shù)都有影響，并呈現(xiàn)出AA型>AB型>BB型，其中B型基因是有利基因[16]。本研究中大白豬群體中A等位基因?yàn)閮?yōu)勢基因，AB型為優(yōu)勢基因型，AA、AB型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)多于BB型個(gè)體，這表示A基因?yàn)榇蟀棕i總產(chǎn)仔性狀的正效基因，對(duì)PRLR基因的A基因進(jìn)行合理地選擇，可能會(huì)有效提高大白豬的總產(chǎn)仔數(shù)，以提高母豬生產(chǎn)效應(yīng)。

表8 FSH-β、PRLR和FUT1合并基因型與大白豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

FUT1是一種巖藻糖轉(zhuǎn)移酶，F(xiàn)UT1基因位于豬的6號(hào)染色體上，多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)其與仔豬腹瀉有關(guān)，但證明FUT1與母豬繁殖形狀的研究很少。吳圣龍對(duì)蘇太豬基因位點(diǎn)各基因型的生產(chǎn)性能比較研究結(jié)果表明，AB基因型的個(gè)體平均生產(chǎn)性能高于基因型BB的個(gè)體，AB基因型的個(gè)體胎斷奶窩質(zhì)量、胎總產(chǎn)仔數(shù)和胎斷奶窩質(zhì)量均顯著高于BB基因型的個(gè)體[17]。在本研究的大白豬群體中，等位基因B為優(yōu)勢基因，BB型為優(yōu)勢基因型。在大白豬中AA型個(gè)體的弱仔數(shù)顯著低于AB、BB，而胎兒的畸形數(shù)卻極顯著高于AB、BB，其他繁殖性狀的各基因型間差異均不顯著，這或許可以說明A基因?yàn)榇蟀棕i弱仔和胎兒畸形性狀的負(fù)效基因，對(duì)FUT1基因的A等位基因進(jìn)行合理選擇，可能會(huì)有效減少大白豬產(chǎn)弱仔和畸形胎兒的數(shù)量，以提高母豬活仔、健仔數(shù)的產(chǎn)出。

合并基因型分析結(jié)果表明，合并基因型的遺傳效應(yīng)高于單個(gè)基因型的遺傳效應(yīng)[18]。在大白豬中FSH-β—PRLR不同合并基因型在總產(chǎn)仔數(shù)、總活仔數(shù)、窩質(zhì)量、出生體質(zhì)量、死胎性狀上不同的基因型皆有顯著性差異。FSH-β—FUT1在大白豬的ABAB型個(gè)體的木乃伊胎數(shù)比BBBB型高；BBAA型個(gè)體的胎兒畸形數(shù)多于AAAB、AABB、ABAB、ABBB、BBAB、BBBB型。PRLR-FUT1在大白豬的木乃伊胎性狀上BBAB型極顯著高于其他各基因型。FSH-β—PRLR—FUT1在大白豬的總產(chǎn)仔數(shù)、總活仔數(shù)、死胎、木乃伊胎、窩質(zhì)量、出生體質(zhì)量性狀上不同基因型皆有一定的差異性。

本研究分析發(fā)現(xiàn)，大白豬繁殖性狀FSH-β—PRLR最優(yōu)分子標(biāo)記組合為AAAA，F(xiàn)SH-β—PRLR—FUT1最優(yōu)分子標(biāo)記組合BBAABB。這提示在種豬繁殖性狀的選育過程中，應(yīng)根據(jù)豬群特征有目的地選擇2個(gè)或多個(gè)影響繁殖性能的候選基因進(jìn)行合并，并結(jié)合分子標(biāo)記輔助育種方法來進(jìn)一步有效地改善母豬的繁殖性狀。

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