楊國一， 于文濤， 蔡春平， 陳 笛， 謝微微， 王鵬杰， 葉乃興

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350002； 2.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建福州 350001)

通信作者：葉乃興，教授，主要從事茶樹栽培育種與資源利用研究，E-mail：ynxtea@126.com；于文濤，博士，農(nóng)藝師，主要從事植物系統(tǒng)學(xué)研究，E-mail：wtyu@foxmail.com。

應(yīng)用掃描電鏡觀察生物樣品表面的微形態(tài)特征，以獲得較光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果更為細(xì)微的結(jié)構(gòu)特征，得到具有特異性功能的微觀結(jié)構(gòu)和具有分類學(xué)意義的微形態(tài)性狀[1-4]，是生物學(xué)研究的重要手段之一。在利用掃描電鏡對生物樣品的微形態(tài)進(jìn)行觀察分析研究中，能否獲得真實(shí)、清晰、理想的掃描電鏡觀察結(jié)果，樣品的制備過程是關(guān)鍵，絕大多數(shù)情況需要對生物樣品進(jìn)行干燥處理后才能鍍金和進(jìn)行掃描電鏡觀察[5]。樣品的前期干燥處理直接影響后期觀察效果，如果處理不好，會直接影響到觀察的清晰度與準(zhǔn)確度，甚至直接導(dǎo)致試驗(yàn)失敗[6]。含水量較多的生物樣品不僅對掃描電鏡成像造成很大的影響，同時(shí)對掃描電鏡儀器設(shè)備也會造成諸多不良后果[7]：樣品含水量多容易造成樣品倉內(nèi)真空度下降，造成電子束偏移，使圖像模糊不清；造成物鏡、鏡頭、光闌等部件的污染；燈絲碰到水蒸氣而氧化變質(zhì)乃至熔斷。目前，植物葉片電鏡掃描研究中的干燥方法主要有烘箱干燥法[8-9]、自然干燥法[10-12]、真空冷凍干燥法[13-16]等方法。

對于茶樹葉片來說，茶樹老葉和嫩葉含水量、角質(zhì)層和上下表皮厚度都有所差異[17]，不同的葉片適合哪種干燥方式，還沒有確切的數(shù)據(jù)支持。為了探討茶樹老、嫩葉片對應(yīng)的最優(yōu)干燥方法，本研究選取3個(gè)品種的茶樹葉片為研究對象，每個(gè)茶樹品種取老葉以及嫩葉作為試驗(yàn)材料，用場發(fā)射掃描電鏡觀察，然后對3種不同的茶樹葉片掃描電鏡樣品制備方法進(jìn)行比較，旨在尋找一種理想的茶樹葉片掃描電鏡樣品制備方法，為茶樹品種葉片微形態(tài)比較研究、茶樹葉片發(fā)育過程的微形態(tài)研究等提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料采自福建農(nóng)林大學(xué)教學(xué)茶園的3個(gè)品種(表1)的茶樹葉片，分別為春梢葉(老葉)和秋梢第3葉(嫩葉)，采樣時(shí)間為2016年10月下旬。

表1 3種茶樹品種的性狀描述

1.2 儀器設(shè)備

SU-8010型冷場發(fā)射掃描電鏡(日立公司，日本)；E-1010 型離子濺射鍍膜儀(日立公司，日本)；DHG-9240A型可編程電熱烘箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司，中國)；FD-1-50型真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，中國)；KQ-300VDE型超聲波清洗儀(江蘇昆山舒美超聲儀器有限公司，中國)。

1.3 試驗(yàn)方法

每個(gè)茶樹品種選取老葉及嫩葉，用超聲波清洗儀去除茶樹葉片表面的雜質(zhì)，于同一葉片中部選取3個(gè)2 mm×2 mm大小的部分葉片作為試驗(yàn)材料，分別進(jìn)行烘箱干燥法、硅膠干燥法和真空冷凍干燥法處理。

烘箱干燥法：將清洗過的茶樹葉片樣品放入60 ℃烘箱中干燥4 h。

硅膠干燥法：將清洗過的茶樹葉片樣品直接放入硅膠中進(jìn)行干燥處理12 h。

真空冷凍干燥法：用2.5%的戊二醛于4 ℃ 冰箱中固定3 h；用0.1 mol/L、pH值6.8的磷酸緩沖液沖洗3次，每次 10 min；分別用50%、70%、80%、90%乙醇進(jìn)行脫水，每次 15 min；用無水乙醇脫水3次，每次15 min；最后將材料置于100%純叔丁醇中浸泡15 min后放入真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥處理。

將3組樣品觀察面向上，用導(dǎo)電膠帶固定于掃描電鏡樣品臺上，用離子濺射鍍膜儀在樣品表面鍍膜80 s。冷場發(fā)射掃描電鏡取8.0 mm工作距離、20 μA燈絲電流、6 kV加速電壓，在200倍和500倍放大倍數(shù)下對茶樹葉片進(jìn)行觀察并拍照。每個(gè)處理在200倍放大倍數(shù)下取10個(gè)視野，對視野中的葉片氣孔數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

由顯微圖像(圖1、圖2、圖3、圖4)可以看出，3個(gè)品種的茶樹葉片背面均有毛被，為單毛；氣孔均為復(fù)唇型氣孔，長卵形且具有腺鱗組織，氣孔器保衛(wèi)細(xì)胞蠟質(zhì)紋飾平滑。茶樹老葉氣孔器保衛(wèi)細(xì)胞均凸出于普通表皮細(xì)胞，氣孔器外圍覆有2層皺脊，內(nèi)層呈平滑、環(huán)狀閉合，外層褶皺、環(huán)狀不閉合，副衛(wèi)細(xì)胞與普通表皮細(xì)胞在同一平面；茶樹嫩葉氣孔器保衛(wèi)細(xì)胞略突出于普通表皮細(xì)胞，氣孔器外圍覆有1層皺脊，呈平滑、環(huán)狀閉合，副衛(wèi)細(xì)胞略低于普通的表皮細(xì)胞。

2.1 茶樹葉表面紋飾與變化

由表2可知，不同茶樹品種葉片腹面均有獨(dú)特的紋飾特征，而相同的茶樹品種經(jīng)不同干燥方法處理后，微形態(tài)特征存在差異。

烘箱干燥法：3個(gè)品種的茶樹葉片經(jīng)過烘箱干燥處理后，在掃描電鏡觀察下，茶樹老葉原始形態(tài)保存良好，可以反映真實(shí)的微形態(tài)特征。而茶樹嫩葉表面發(fā)生較為嚴(yán)重的收縮，葉片腹面褶皺較為嚴(yán)重， 其表面紋飾均不能反映其真實(shí)的微形態(tài)特征。

硅膠干燥法：經(jīng)過硅膠干燥處理后的茶樹老葉，在掃描電鏡觀察下，3個(gè)品種的茶樹葉片并沒有發(fā)生嚴(yán)重的皺縮現(xiàn)象。茶樹嫩葉經(jīng)硅膠干燥處理后，在掃描電鏡觀察下，其葉表面發(fā)生嚴(yán)重的收縮，葉片腹面褶皺嚴(yán)重，其表面紋飾不能反映真實(shí)的微形態(tài)特征。

真空冷凍干燥法：3個(gè)品種的茶樹葉片經(jīng)過真空冷凍干燥處理后，在掃描電鏡觀察下，茶樹老葉和嫩葉的原始形態(tài)均保存良好，均可以反映真實(shí)的微形態(tài)特征。

表2 3種干燥方法對茶樹葉片微形態(tài)的影響

2.2 茶樹葉表面氣孔密度與變化

對3個(gè)品種的茶樹老葉和嫩葉進(jìn)行氣孔密度統(tǒng)計(jì)及方差分析(表3)，在茶樹老葉結(jié)果方面，本山和鐵觀音2個(gè)品種的老葉經(jīng)3種方法處理后，其氣孔密度差異不顯著，而黃旦經(jīng)硅膠干燥法處理后氣孔密度與烘箱干燥法和真空冷凍干燥法均差異顯著；在茶樹嫩葉結(jié)果方面，3個(gè)茶樹品種經(jīng)烘箱干燥法和硅膠干燥法處理后氣孔密度均與真空冷凍干燥法差異顯著，其氣孔密度較真空冷凍干燥法均產(chǎn)生了較大的增加，其中本山嫩葉經(jīng)烘箱干燥法處理后，氣孔密度達(dá)到了 437.67 個(gè)/mm2，較真空冷凍干燥法增加了53.75%。

2.3 綜合分析

茶樹葉片經(jīng)3種不同干燥方法處理后，茶樹老葉和嫩葉呈現(xiàn)出不同變化：茶樹老葉經(jīng)烘箱干燥法或真空冷凍法處理后，其葉片未發(fā)生收縮現(xiàn)象，表面紋飾和氣孔密度均未受到影響，能反映真實(shí)的微形態(tài)特征，而經(jīng)硅膠干燥法處理后，雖然3個(gè)茶樹品種的葉片微形態(tài)特征均在視野中保存較好，但黃旦品種氣孔密度異常，因此硅膠干燥法并不適用于所有茶樹品種老葉干燥處理；茶樹嫩葉經(jīng)真空冷凍干燥法處理后，葉表面未產(chǎn)生收縮現(xiàn)象，其表面紋飾和氣孔密度均未受到影響，能反映真實(shí)的微形態(tài)特征， 而經(jīng)烘箱干燥法或硅膠干燥法處理后，均發(fā)生嚴(yán)重的收縮現(xiàn)象，葉片表面紋飾和氣孔密度均受到了不同程度的影響，不能反映真實(shí)的茶樹葉片微形態(tài)特征，因此烘箱干燥法和硅膠干燥法并不適用于茶樹嫩葉的干燥處理。

表3 經(jīng)3種干燥方法處理后的茶樹葉片平均氣孔密度及方差分析結(jié)果

注：同列數(shù)據(jù)后的不同小寫字母表示不同處理方法差異顯著(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

本研究中3種茶樹葉片掃描電鏡樣品制備干燥方法的原理各不相同：烘箱干燥法是利用熱空氣將熱量傳遞給葉片，氣化葉片中的水分，形成水蒸氣，從而達(dá)到快速干燥的效果；硅膠干燥法是通過硅膠干燥劑內(nèi)部的毛細(xì)孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)吸收水分，并通過其物理吸引力將水分保留，從而使樣品脫水干燥；真空冷凍干燥法是將葉片在較低的溫度下凍結(jié)成固態(tài)，然后在真空條件下使其中的水分不經(jīng)液態(tài)直接升華為氣態(tài)，最終使葉片脫水。對茶樹葉片進(jìn)行干燥處理時(shí)，由于水具有較大的內(nèi)聚力和電極性，可與樣品中的極性成分瞬間結(jié)合，在揮發(fā)干燥時(shí)會牽動樣品組分，如果葉片較嫩，含水量較高，有可能造成樣品收縮變形或微小斷裂。在茶樹老葉掃描電鏡制樣過程中，由于其含水量少，角質(zhì)層和上下表皮厚度較厚等特點(diǎn)，烘箱干燥法和真空冷凍干燥法均適合， 但考慮到真空冷凍干

燥法的操作復(fù)雜性及成本相對較高，在進(jìn)行茶樹老葉片的掃描電鏡研究中，采用烘箱干燥法是簡便、經(jīng)濟(jì)、快速的制樣方法。在茶樹嫩葉掃描電鏡制樣過程中，茶樹嫩葉含水較多，角質(zhì)層和上下表皮厚度較薄，采用烘箱干燥法或硅膠干燥法處理時(shí)容易發(fā)生變形收縮現(xiàn)象，影響觀察結(jié)果，而真空冷凍干燥法是選用高熔點(diǎn)的有機(jī)溶劑——叔丁醇作升華介質(zhì)，使水分從固態(tài)直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，不經(jīng)過液態(tài)階段，因而避免了氣相和液相之間表面張力對樣品的損傷[18]。

綜上，在茶樹品種葉片微形態(tài)學(xué)比較研究、茶樹葉片發(fā)育過程研究等茶樹葉片微形態(tài)學(xué)相關(guān)研究中，如果選用茶樹老葉作為研究材料，建議采用更簡便、經(jīng)濟(jì)、快速的烘箱干燥法進(jìn)行樣品制備；如果需要對嫩葉的微形態(tài)特征進(jìn)行觀察，建議采用保留真實(shí)形態(tài)更佳的真空冷凍干燥法作為掃描電鏡樣品制備的優(yōu)選方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]Guan H Y，Han Z W，Cao H N，et al. Characterization of multi-scale morphology and superhydrophobicity of water bamboo leaves and biomimetic polydimethylsiloxane(PDMS) replicas[J]. Journal of Bionic Engineering，2015，12(4)：624-633.

[2]Lu L，Wang H，Blackmore S，et al. Pollen morphology of the tribe Rhinantheae (Orobanchaceae) and its systematic significances[J]. Plant Systematics and Evolution，2007，268(1/2/3/4)：177-198.

[4]Yu W T，Jacques F M，Chen S T，et al. Nutlet micro-morphology of the genusMicroula(Boraginaceae) from the Qinghai-Tibetan Plateau，and its systematic implications[J]. Nordic Journal of Botany，2012，30(5)：596-612.

[5]徐柏森，楊 靜. 實(shí)用電鏡技術(shù)[M]. 南京：東南大學(xué)出版社，2008：93-96.

[6]曹君邁，貝盞臨，江 涌，等. 枸杞花蕾掃描電鏡制樣方法的探討[J]. 北方園藝，2010(3)：30-32.

[7]郭素枝. 掃描電鏡技術(shù)及其應(yīng)用[M]. 廈門：廈門大學(xué)出版社，2006：74-84.

[8]侯燕鳴，胡劍江，方 薔，等. 掃描電鏡的不同含水量植物葉片樣品的處理及觀察方法研究[J]. 分析儀器，2011(5)：45-48.

[9]Yuparat P，Singhanat P，William L K. The effects of pre-drying treatments and different drying methods on phytochemical compound retention and drying characteristics of moringa leaves(MoringaoleiferaLam.)[J]. Drying Technology，2014，32(16)：1970-1985.

[10]茍占平，萬德光. 電鏡掃描葉片鑒定川渝商品金銀花的植物來源[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19(10)：2507-2508.

[11]石 婕，劉慶倩，安海龍，等. 不同污染程度下毛白楊葉表面PM2.5顆粒的數(shù)量及性質(zhì)和葉片氣孔形態(tài)的比較研究[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2015，35(22)：7522-7530.

[12]Farraant J M，Lehner A，Cooper K，et al. Desiccation tolerance in the vegetative tissues of the fernMohriacaffrorumis seasonally regulated[J]. The Plant Journal，2009，57(1)：65-79.

[13]戴葉輝，王 琳，邢福武，等. 13種榕屬植物的葉片結(jié)構(gòu)及其對環(huán)境的適應(yīng)性[J]. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，25(4)：5-13.

[14]張艷霞，朱必娟，肖德興. 印度橡皮榕與紫葉橡皮榕葉片的解剖結(jié)構(gòu)[J]. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，23(3)：31-35.

[15]Antal T，Chong C H，Law C L，et al. Effects of freeze drying on retention of essential oils，changes in glandular trichomes of lemon balm leaves[J]. International Food Research Journal，2014，21(1)：387-394.

[16]Pathan A K，Bond J，Gaskin R E. Sample preparation for SEM of plant surfaces[J]. Materials Today，2010，12(1)：32-43.

[17]黃曉敏. 閩南茶區(qū)不同烏龍茶品種葉片顯微結(jié)構(gòu)比較研究[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2010.

[18]肖 媛，劉 偉，汪 艷，等. 生物樣品的掃描電鏡制樣干燥方法[J]. 實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2013，32(5)：45-53.