廖秋萍， 陳根元， 賈琦珍， 王 帥

(塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

通信作者：王 帥，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事動(dòng)物中毒病及毒理學(xué)方面的研究。E-mail：wangshuaidky@126.com。

小花棘豆(OxytropisglabraDC.)是瘋草的一種，在新疆天然草地中廣泛分布，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)僅新疆阿克蘇地區(qū)天然草場(chǎng)中廣泛叢生小花棘豆的面積已超過20%。目前放牧家畜小花棘豆中毒對(duì)新疆草原畜牧業(yè)的發(fā)展危害嚴(yán)重，每年中毒的家畜占放牧總數(shù)的5%～10%，其中50%左右的中毒家畜死亡[1]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，小花棘豆中毒對(duì)動(dòng)物的繁殖機(jī)能影響極為明顯，可導(dǎo)致公畜性欲下降，精子活力降低[2]，母畜不孕、流產(chǎn)、難產(chǎn)，甚至幼畜死亡[3]。目前，研究認(rèn)為動(dòng)物體內(nèi)的內(nèi)分泌系統(tǒng)包括丘腦-垂體-甲狀腺軸、丘腦-垂體-腎上腺軸和丘腦-垂體-性腺軸3大系統(tǒng)，而動(dòng)物的生殖功能依賴于內(nèi)分泌腺與神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，在生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)中，丘腦-垂體-性腺軸通過調(diào)節(jié)動(dòng)物的性激素水平維系動(dòng)物的生殖功能[4]。在雄性動(dòng)物中，丘腦-垂體-性腺軸由丘腦、垂體和睪丸構(gòu)成。王帥等研究發(fā)現(xiàn)小花棘豆中毒家兔腦組織和生殖器官均發(fā)生以空泡變性為主要特征的病理學(xué)變化，而且與小花棘豆攝入量有明顯的時(shí)間-劑量效應(yīng)[5]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)小花棘豆中毒可通過影響綿羊丘腦-垂體-性腺軸中α-甘露糖苷酶的活性與表達(dá)，從而導(dǎo)致綿羊繁殖機(jī)能障礙[6]。

和田羊是新疆南疆地區(qū)的主要放牧品種，在該地區(qū)畜牧業(yè)中占有重要地位，占該地區(qū)綿羊存欄數(shù)的70.97%。近年來(lái)，和田羊小花棘豆中毒已成為該地區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展面臨的嚴(yán)重問題[7]。本試驗(yàn)通過制備小花棘豆中毒和田羊丘腦、垂體、睪丸的組織切片，利用HE染色及電子顯微鏡分別對(duì)中毒和田羊丘腦、垂體和睪丸組織的病理結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，分析小花棘豆毒性成分對(duì)和田羊生殖內(nèi)分泌的影響，進(jìn)一步探討動(dòng)物小花棘豆中毒的機(jī)理，為小花棘豆中毒的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑與儀器

小花棘豆(OxytropisglabraDC.)樣品采自新疆和田市策勒縣恰哈鄉(xiāng)，由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)教研室鑒定，取植株的地上部分，風(fēng)干后備用。

伊紅、蘇木精、苦味酸、乙醇、甲醛、二甲苯等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

CX41型生物顯微鏡，日本Olympus；HT7700型透射電子顯微鏡，日本Hitachi；RM2235型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，德國(guó)Leica；TB-718型分體式生物組織包埋機(jī)，湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司；YT-7C型生物組織攤烤片機(jī)，湖北孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

雄性和田羊6只，體質(zhì)量(32±1.4 kg)，購(gòu)自兵團(tuán)第十四師一牧場(chǎng)，其中對(duì)照羊1只，小花棘豆攻毒羊5只。對(duì)照羊自由采食青干草，每日補(bǔ)飼精料300 g，試驗(yàn)組飼喂小花棘豆粉，每天按20 g/kg的劑量與300 g精料加水混勻，每天飼喂3次，即08：00—09：00、14：00—15：00、19：00—20：00，自行采食完后飼喂青干草，自由飲水。待試驗(yàn)組均出現(xiàn)喜臥、站立不穩(wěn)、以手提耳即出現(xiàn)搖頭、易突然倒地等典型臨床癥狀后進(jìn)行屠宰，試驗(yàn)期35 d。

1.3 和田羊丘腦、垂體和睪丸病理組織結(jié)構(gòu)的觀察

取對(duì)照和田羊與中毒和田羊的丘腦、垂體和睪丸組織，分別稱取質(zhì)量，再除以羊宰前體質(zhì)量，即得各器官指數(shù)。然后取部分組織使用Bouin’s液(飽和苦味酸溶液75 mL，40%甲醛溶液25 mL，冰乙酸5 mL)固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后常規(guī)步驟石蠟包埋。包埋組織進(jìn)行連續(xù)切片，片厚6 μm，攤片、烤片后，常規(guī)HE染色方法染色，鏡檢觀察。

1.4 和田羊丘腦、垂體和睪丸超微結(jié)構(gòu)的觀察

分別取對(duì)照和田羊與中毒和田羊的丘腦、垂體和睪丸組織，部分組織切成1 mm2左右的組織塊后使用2.5%戊二醛固定，經(jīng)過脫水、滲透、包埋、聚合、切片、染色等步驟后使用透射電子顯微鏡在80 kV電壓下，觀察各組織的超微結(jié)構(gòu)的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 小花棘豆中毒對(duì)和田羊丘腦、垂體和睪丸指數(shù)的影響

由表1可知，中毒和田羊丘腦指數(shù)、垂體指數(shù)和睪丸指數(shù)均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，表明飼喂小花棘豆對(duì)和田羊?qū)嵸|(zhì)性臟器有較大的損傷。

表1 小花棘豆中毒對(duì)和田羊丘腦、垂體和睪丸指數(shù)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.2 小花棘豆中毒和田羊丘腦、垂體和睪丸病理組織結(jié)構(gòu)的觀察

小花棘豆中毒和田羊病理剖檢可見腦膜血管充血，其他臟器無(wú)明顯肉眼可見變化。HE染色結(jié)果(圖1)表明，與對(duì)照羊相比，小花棘豆中毒和田羊丘腦神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞體均發(fā)生固縮，胞質(zhì)中充滿顆粒狀尼氏體或深紫色小塊，胞核發(fā)生碎裂、濃染；垂體中可見嗜堿性細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和嫌色細(xì)胞，其細(xì)胞核多發(fā)生變形、濃染，胞漿減少；睪丸中各級(jí)生精細(xì)胞排列紊亂，層數(shù)減少，管腔中的成熟精子數(shù)也明顯降低，生精小管周圍間隙變寬，睪丸支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)明顯空泡。

2.3 小花棘豆中毒和田羊丘腦、垂體和睪丸超微結(jié)構(gòu)的觀察

經(jīng)透射電鏡檢查，對(duì)照和田羊丘腦中神經(jīng)細(xì)胞染色質(zhì)分布均勻，核膜完整，線粒體內(nèi)嵴清晰，神經(jīng)髓鞘排列緊密，呈層狀結(jié)構(gòu)(圖2-A)；垂體中可見促性腺激素細(xì)胞，其胞質(zhì)中分泌顆粒大小不一，胞漿中線粒體、高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器均清晰可見(圖2-B)；睪丸中精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞和精子細(xì)胞均正常(圖2-C)。小花棘豆中毒和田羊丘腦中神經(jīng)細(xì)胞染色質(zhì)聚集成塊，細(xì)胞核腫脹、破裂，線粒體嵴發(fā)生斷裂，神經(jīng)髓鞘排列模糊不清，板層結(jié)構(gòu)離散，有些發(fā)生斷裂，另并有髓鞘球產(chǎn)生(圖2-D)；垂體細(xì)胞中染色質(zhì)聚集，胞核碎裂，線粒體腫脹、空泡化，嵴斷裂，并可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張(圖2-E)；睪丸中精原細(xì)胞和精母細(xì)胞均可見細(xì)胞核中染色質(zhì)聚集，胞漿中的線粒體腫脹、空泡化，嵴斷裂，支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞核局部核膜不完整，成分裂狀，線粒體嵴斷裂，空泡增多，胞漿減少，精子細(xì)胞頂體膜和核膜破裂、不完整，胞質(zhì)內(nèi)線粒體形成空泡，染色質(zhì)聚集(圖2-F)。試驗(yàn)結(jié)果表明小花棘豆攻毒后和田羊丘腦、垂體和睪丸細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化明顯。

3 結(jié)論與討論

臟器指數(shù)可直觀地反映毒性物質(zhì)對(duì)動(dòng)物內(nèi)臟器官的影響， 其變化可用于初步判斷毒性物質(zhì)對(duì)動(dòng)物內(nèi)臟器官的損害程度。丘腦、垂體和睪丸是雄性動(dòng)物繁殖系統(tǒng)的重要器官，其中垂體是家畜分泌激素調(diào)控中心，睪丸是多種垂體激素的作用受體。本試驗(yàn)中小花棘豆中毒和田羊丘腦指數(shù)、垂體指數(shù)和睪丸指數(shù)均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，與鄧?yán)鹊难芯拷Y(jié)果[8]一致。試驗(yàn)結(jié)果表明，小花棘豆毒性成分對(duì)和田羊丘腦、垂體和睪丸組織均有較大程度的損傷，其對(duì)中毒動(dòng)物繁殖機(jī)能的影響可能與丘腦-垂體-睪丸軸損傷有關(guān)。

丘腦是調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動(dòng)和內(nèi)分泌活動(dòng)的較高級(jí)神經(jīng)中樞所在，可分為弓狀核、視交叉上核、視上核、室旁核等部分；垂體包括腺垂體和神經(jīng)垂體，主要由嗜堿性細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和嫌色細(xì)胞組成，其中嗜堿性細(xì)胞包括促性腺激素細(xì)胞、促甲狀腺激素細(xì)胞和促腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞，嗜酸性細(xì)胞包括生長(zhǎng)激素細(xì)胞和催乳素細(xì)胞；睪丸組織主要由支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和各級(jí)生精細(xì)胞組成。本試驗(yàn)中，小花棘豆中毒和田羊丘腦神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均發(fā)生固縮、胞核碎裂、濃染；垂體中細(xì)胞多發(fā)生胞核變形、濃染，胞漿減少；睪丸中各級(jí)生精細(xì)胞排列紊亂，層數(shù)減少，管腔中的成熟精子數(shù)也明顯降低，生精小管周圍間隙變寬，睪丸支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)明顯空泡。賈琦珍等的研究發(fā)現(xiàn)小花棘豆中毒可顯著影響家兔丘腦中α-甘露糖苷酶的活性與表達(dá)，并可導(dǎo)致家兔丘腦細(xì)胞損傷[9]；丁伯良等的研究認(rèn)為甘肅棘豆(主要毒性成分為苦馬豆素，與小花棘豆一致)中毒山羊睪丸的曲細(xì)精管及生精上皮細(xì)胞明顯損傷[10]。本試驗(yàn)結(jié)果均與之一致，結(jié)果表明小花棘豆毒性成分可作用于和田羊丘腦-垂體-睪丸軸，導(dǎo)致其激素分泌受阻，精子無(wú)法正常發(fā)生，直接影響精子質(zhì)量，從而影響雄性和田羊的生殖功能。

丘腦中的神經(jīng)元多為內(nèi)分泌神經(jīng)元，主要調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，其中與動(dòng)物生殖功能密切相關(guān)的為促性腺激素釋放激素神經(jīng)元。垂體可控制動(dòng)物機(jī)體中與生長(zhǎng)、代謝、發(fā)育和繁殖等功能相關(guān)的激素分泌，但這些激素分泌依賴于相應(yīng)的分泌細(xì)胞。睪丸是雄性動(dòng)物主要的生殖器官，其主要功能是分泌雄性激素，產(chǎn)生精子。其精子發(fā)生的過程是由相對(duì)不分化的精原細(xì)胞逐漸發(fā)育為高度分化的成熟精子。本試驗(yàn)結(jié)果表明，小花棘豆中毒和田羊丘腦中神經(jīng)細(xì)胞染色質(zhì)聚集成塊，細(xì)胞核腫脹、破裂，線粒體嵴發(fā)生斷裂，神經(jīng)髓鞘排列模糊不清，板層結(jié)構(gòu)離散，有些發(fā)生斷裂，另并有髓鞘球產(chǎn)生。髓鞘可以提高神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)的速度，保護(hù)軸突，在維持腦功能中起著重要的作用[11]。髓鞘結(jié)構(gòu)的紊亂會(huì)降低神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)效率，小花棘豆毒性成分可能借此影響動(dòng)物的丘腦功能。中毒羊垂體細(xì)胞中染色質(zhì)聚集，胞核碎裂，線粒體腫脹、空泡化，嵴斷裂，并可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。線粒體可為細(xì)胞提供生命活動(dòng)所必需的能量，在細(xì)胞代謝中占有重要地位。因此，細(xì)胞內(nèi)線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變可能會(huì)直接影響細(xì)胞的功能，如激素的分泌和釋放等。睪丸中精原細(xì)胞和精母細(xì)胞均可見細(xì)胞核中染色質(zhì)聚集，胞漿中的線粒體腫脹、空泡化，嵴斷裂，支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞核局部核膜不完整，成分裂狀，線粒體嵴斷裂，空泡增多，胞漿減少，精子細(xì)胞頂體膜和核膜破裂、不完整，胞質(zhì)內(nèi)線粒體形成空泡，染色質(zhì)聚集。支持細(xì)胞是雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)的重要組成部分，作為生精上皮中的唯一體細(xì)胞，對(duì)生殖細(xì)胞具有支持和營(yíng)養(yǎng)的作用，間質(zhì)細(xì)胞主要合成和分泌睪酮，具有促進(jìn)生殖器官發(fā)育，維持正常性欲及動(dòng)物第二性征等作用，并可調(diào)節(jié)生精上皮的生精過程[12]。小花棘豆毒性成分可顯著影響雄性和田羊支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變，可能會(huì)對(duì)雄性激素的分泌與生精過程產(chǎn)生直接影響，進(jìn)而影響精子形成的其它環(huán)節(jié)，從而影響雄性動(dòng)物的生殖功能。

小花棘豆攻毒可導(dǎo)致雄性和田羊丘腦、垂體和睪丸的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的病理變化，其中中毒和田羊丘腦指數(shù)、垂體指數(shù)和睪丸指數(shù)均極顯著升高(P<0.01)，丘腦神經(jīng)元細(xì)胞固縮、濃染；垂體中細(xì)胞核變形、濃染，胞漿減少；睪丸曲精細(xì)管細(xì)胞排列紊亂，管壁變薄，管腔內(nèi)精子數(shù)量減少，睪丸支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)明顯空泡。透射電鏡結(jié)果顯示，小花棘豆中毒和田羊丘腦中神經(jīng)元細(xì)胞核染色質(zhì)聚集，線粒體嵴斷裂，神經(jīng)髓鞘端板層離散；垂體中促性腺激素細(xì)胞核染色質(zhì)聚集，線粒體腫脹呈空泡狀，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；睪丸中精原細(xì)胞和精母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹形成空泡，精子細(xì)胞核膜破裂，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹形成空泡，嵴斷裂，部分精子細(xì)胞缺少頂體顆粒。小花棘豆中毒可造成雄性和田羊丘腦、垂體及睪丸組織顯微和超微結(jié)構(gòu)的改變，從而影響其繁殖機(jī)能。

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