杜芳玲，王婷婷綜述；劉洋，萬臘根校審

(1、南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江西 南昌 330006；2、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006)

1 LAMP技術(shù)特征

1.1 LAMP原理 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒溫條件下（65℃左右）保溫約60min，即可完成核酸擴增。

1.2 擴增產(chǎn)物的檢測方法 目前應(yīng)用較廣泛的有以下三種方法：⑴目測或濁度檢測：通過對擴增過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物-焦磷酸鎂沉淀來檢測判斷有無擴增產(chǎn)物；⑵熒光檢測：在反應(yīng)液中加入SYBR GreenΙ，可在紫外燈下通過肉眼判定；⑶電泳檢測：由于擴增后的產(chǎn)物是一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜結(jié)構(gòu)的DNA片段混合物，電泳后在凝膠上顯示不同大小區(qū)帶的階梯式圖譜

1.3 LAMP的技術(shù)特點 ⑴快速、高效。不需要預(yù)先的雙鏈DNA的熱變性，避免了溫度循環(huán)而造成的時間損失。⑵高靈敏度。對某些病原體的擴增，模板只要幾個拷貝數(shù)，與PCR相比高出幾個數(shù)量級。⑶高特異性。針對靶序列的6個區(qū)域設(shè)計的4種特異性引物，6個區(qū)域中如有一處與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴增。⑷產(chǎn)物檢測方便。LAMP在合成DNA的過程中會產(chǎn)生大量的焦磷酸根離子，能與鎂離子結(jié)合生成白色的焦磷酸鎂沉淀，因此可以根據(jù)反應(yīng)體系中是否生成白色沉淀來判斷反應(yīng)的進(jìn)行情況。⑸操作簡單。LAMP反應(yīng)只需要一個簡單的恒溫器，水浴鍋、金屬浴均可完成此實驗，并不需要昂貴的儀器，可操作性強。

2 研究進(jìn)展

2.1 難培養(yǎng)病原微生物的檢測 由于傳統(tǒng)病原微生物的分離、培養(yǎng)、鑒定往往操作程序繁瑣，等待結(jié)果時間較長，而LAMP克服了這些缺點能在傳統(tǒng)培養(yǎng)病原微生物檢測中發(fā)揮優(yōu)勢。與此同時，部分致病菌受培養(yǎng)條件的限制而不易檢出，則更促進(jìn)了LAMP技術(shù)在這類難培養(yǎng)病原體的檢測取得了較大進(jìn)展，已出現(xiàn)很多報道。

結(jié)核分枝桿菌采用固體培養(yǎng)基分離培養(yǎng)耗時長易混入其他細(xì)菌，直接涂片染色鏡檢極易漏診，因此IWAMOTO[1]等根據(jù)gyr B基因序列設(shè)計針對結(jié)核分枝桿菌的引物，用LAMP方法從痰標(biāo)本中鑒定結(jié)核分枝桿菌，通過檢測24株分枝桿菌和7株非分枝桿菌證實了LAMP法的特異性和敏感性。劉暢[2]等針對艱難梭菌毒素A基因設(shè)計引物建立LAMP法與熒光定量PCR對比，驗證其靈敏度和特異度。SEKI[3]等在肺炎鏈球菌的特異性基因序列l(wèi)ytA上設(shè)計6條引物，用LAMP法檢測10株肺炎鏈球菌和6株非肺炎鏈球菌驗證其特異性，并發(fā)現(xiàn)LAMP較PCR法檢測肺炎鏈球菌敏感1000倍，具有潛在診斷價值。

2.2 非培養(yǎng)病原微生物的檢測

2.2.1 DNA病毒與RNA病毒的檢測 ⑴對RNA病毒的檢測臨床上SARS-CoV的檢測方法主要有兩種，一種是檢測SARS-CoV抗體，雖然這種方法的敏感性較高，但需在發(fā)病10d后才可檢出；另一種方法是定量PCR，這種方法可在發(fā)病早期檢出SARS-CoV，但是需要復(fù)雜的儀器和昂貴的試劑，不便于在SARS暴發(fā)時進(jìn)行常規(guī)檢查。Hong等[4]根據(jù)LAMP的原理設(shè)計了實時定量逆轉(zhuǎn)錄LAMP方法，以快速檢測SARS-CoV，結(jié)果RT-LAMP的靈敏度是RT-PCR的100倍，最低檢測極限是0.01 PFU，表明在臨床檢測中具有明顯的優(yōu)勢。Poon[5]等采用PCR和LAMP來擴增甲型流感病毒的RNA，其中LAMP反應(yīng)條件是在60℃的恒溫下反應(yīng)2h，而PCR實驗中，反應(yīng)需進(jìn)行35次循環(huán)。每一反應(yīng)結(jié)束后，以瓊脂電泳分析法來測定各反應(yīng)靈敏度發(fā)現(xiàn)LAMP為PCR的10倍以上。

⑵對DNA病毒的檢測 Enomoto[6]等利用LAMP技術(shù)設(shè)計了單純皰疹病毒HSV-1、HSV-2的特異性引物來擴增HSV-l和HSV-2基因，敏感性達(dá)到500-1000拷貝/反應(yīng)管。Odari等[7]針對HIV-1型整合酶基因設(shè)計引物，用LAMP方法對HIV-1型M亞型組病毒載量進(jìn)行半定量，定量最低限度為9800拷貝/ml，該研究表明LAMP作為半定量測定病毒載量的方法具有一定應(yīng)用價值。但是，在驗證擴增產(chǎn)物中非靶基因產(chǎn)物上還須進(jìn)一步提高引物特異性。

2.3 其它病原體的檢測 除了常見病原體檢測外，LAMP技術(shù)在原蟲、真菌等方面的應(yīng)用也較傳統(tǒng)的培養(yǎng)法、ELISA及PCR法上具有明顯優(yōu)勢，應(yīng)用較為廣泛。Zhao F[8]等采用LAMP方法檢測臨床上12例常見呼吸道病原體和39例肺炎支原體DNA，并與PCR和實時PCR對比驗證，發(fā)現(xiàn)靈敏度和特異度均較高，檢測下限為102拷貝。

Shirzad Fallahi[9]等針對弓形蟲的RE和B1片段作為靶基因設(shè)計引物，用LAMP方法檢測白血病兒童血液中的弓形蟲，發(fā)現(xiàn)LAMP的靈敏度和特異度均比巢式PCR高，且B1作為靶基因采用LAMP在免疫力低下患者標(biāo)本中檢測弓形蟲具有很高的診斷價值。

真菌是引起食物中毒常見的微生物，黃曲霉素是真菌中毒性極強的劇毒物質(zhì)，但其分離培養(yǎng)周期長，Liu等[10]提出用LAMP快速檢測食品中黃曲霉素的方法，檢出率達(dá)100%，表明可能是一種檢測黃曲霉菌保證食品安全有效途徑。

LAMP還可應(yīng)用于乙型肝炎病毒 (HBV)[11]、流感病毒(H1-H3)[5]、水痘帶狀病毒(VZV)[12]、假結(jié)核耶爾森氏菌[13]、人類皰疹病毒7[14]、瘧原蟲[15]等病原體的檢測以及動物胚胎性別鑒定[16]。

2.4 耐藥性檢測 近年來，隨著抗生素的廣泛使用，細(xì)菌耐藥率在不斷上升，對耐藥基因的檢測已成為全球關(guān)注的熱點問題。王歡[17]等針對銅綠假單胞菌OprD2耐藥基因設(shè)計兩對引物，利用LAMP進(jìn)行快速擴增。加入核酸染料HNB直接肉眼判讀結(jié)果，檢測和分析了47株銅綠假單胞菌OprD2耐藥基因的分布情況及其與抗生素耐受性的相關(guān)性。該方法的靈敏度比常規(guī)PCR高10倍，檢出率(51%)與PCR檢出率相當(dāng)。適用于直接檢測臨床標(biāo)本中銅綠假單胞菌的耐藥基因以指導(dǎo)臨床用藥。李秀梅等[18]在金黃色葡萄球菌的新霉素耐藥基因aph保守區(qū)設(shè)計一套特異性的引物，結(jié)果表明LAMP靈敏度與PCR相當(dāng)，檢測限約20個拷貝。

Solanki等[19]對產(chǎn)碳青烯酶的革蘭陰性菌株的blaNDM-1和blaKPC基因設(shè)計引物進(jìn)行LAMP藥敏試驗，對比普通PCR和表型驗證試驗結(jié)果，認(rèn)為LAMP在耐藥基因檢測方面有潛在應(yīng)用價值，這也給臨床提供了一種檢測質(zhì)粒介導(dǎo)的碳青霉烯酶新型快捷又簡便的有效檢測方法。

2.3 基因分型等的應(yīng)用 此外，LAMP在基因分型、腫瘤轉(zhuǎn)移生物標(biāo)志物檢測等方面也有報道。最近有證據(jù)表明藥物副作用的發(fā)生率和人類白細(xì)胞抗原(HLA)等位基因型有密切關(guān)系。因此Cheng等[20]利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)鑒定HLA-B1502，取得了良好的效果。分別用LAMP、基底序列(SBT)和PCR的方法檢測450例樣本的B1502狀態(tài)。最終LAMP與SBT和PCR符合率為100%。研究證實，LAMP可以用于檢測HLA基因分型，且成本低、時間短，能夠有效解決臨床實際困難。

2.4 流行病學(xué)研究 楊俊發(fā)[21]等利用LAMP方法對肺部非典型感染進(jìn)行病原學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)在肺部非典型感染早期病原學(xué)檢查和前瞻性指導(dǎo)中具有很好的潛在應(yīng)用價值。同時采用LAMP技術(shù)對嗜肺軍團(tuán)菌引起的社區(qū)獲得性重癥肺炎的常見病原體診斷進(jìn)行回顧性研究[22]，認(rèn)為LAMP方法準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟，可為臨床早期抗生素治療提供病原學(xué)依據(jù)。

2.5 LAMP相關(guān)衍生技術(shù) 為充分利用LAMP技術(shù)的優(yōu)勢，擴展其應(yīng)用范圍、提高檢測的效率及可靠性，近年來，在LAMP技術(shù)的基礎(chǔ)上已衍生出很多相關(guān)的基因檢測技術(shù)，包括實時LAMP(real time-LAMP)、HtL-LAMP、 多重LAMP和原位 LAMP技術(shù)等。實時定量LAMP檢測避免了反應(yīng)管的開管，便于對擴增體系進(jìn)行優(yōu)化，也利于對靶標(biāo)分子進(jìn)行定量檢測，其中應(yīng)用最廣的有濁度儀檢測[23]以及生物發(fā)光[24]等實時檢測法。LAMP可與芯片技術(shù)相結(jié)合實現(xiàn)對大量樣本的高通量快速檢測。Britton S等[25]利用此方法檢測多個地區(qū)的大量臨床標(biāo)本中的惡性瘧原蟲，基于顏色變化判讀擴增結(jié)果，結(jié)果靈敏度較高，特異性較PCR低，有應(yīng)用價值，目前技術(shù)不成熟，LAMP實現(xiàn)高通量的能力還受到一定限制。

2003年Maruyama[26]等將LAMP和原位雜交相結(jié)合，建立了原位LAMP(1n-SituLAMP)，用于檢測組織細(xì)胞中的E.coli O157：H7。同原位PCR相比，其優(yōu)點是使用相對較低的溫度，可減少細(xì)胞的破壞，有利于同步應(yīng)用熒光抗體進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

多重LAMP擴增，即反應(yīng)體系中混合有多組擴增引物進(jìn)行擴增反應(yīng)，實現(xiàn)同時對不同靶序列的擴增反應(yīng)。2006年申建維[27]等將核酸雜交和LAMP技術(shù)結(jié)合來檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，金黃色葡萄球菌耐藥基因meca和fe-mA通過多重LAMP擴增，加入2種不同熒光探針分別與meca和femA基因的擴增產(chǎn)物互補結(jié)合，最后檢測反應(yīng)管中的2種熒光值。結(jié)果該方法的最低檢測限為10CFU/ml，與藥敏試驗結(jié)果相比較，靈敏度99.0%，特異度90.9%，證明該方法檢測靈敏、特異性高，操作簡便快速，適用于臨床樣品的直接快速基因檢測。此次試驗的創(chuàng)新之處在于將核酸雜交與LAMP相結(jié)合，利用不同熒光探針進(jìn)行標(biāo)記，大大提高了對擴增產(chǎn)物檢測的特異性和靈敏度。盡管如此，由于加入的引物數(shù)目較多，容易導(dǎo)致引物二聚體的形成，從而加劇引物來源的非特異擴增問題。此外LAMP使用的DNA聚合酶具有一些特殊的性質(zhì)如鏈置換活性，可能出現(xiàn)產(chǎn)物量大、分子量高或仍呈現(xiàn)梯形分布的非特異擴增產(chǎn)物。

3 展望

3.1 方法局限性 LAMP在基因擴增方面具有很大優(yōu)勢，但是卻一直很難在臨床上得到廣泛應(yīng)用，主要可能有幾個原因。⑴對靶序列和引物的長度有很高要求以確保特異性擴增，在引物設(shè)計上難度較大。⑵反應(yīng)結(jié)果只有擴增和不擴增兩種，一旦出現(xiàn)非特異性的擴增，則不易鑒別。⑶由于方法靈敏度高，在檢測過程中由于加樣、EP管的開蓋、氣溶膠的形成等極易發(fā)生污染，導(dǎo)致假陽性的結(jié)果。大量研究推薦使用濁度計等不開蓋方法檢測擴增產(chǎn)物。但這類措施并不能在根本上解決假陽性率高這一問題，可能還會存在非特異性擴增。此類非特異擴增產(chǎn)物的出現(xiàn)與引物序列性質(zhì)、反應(yīng)時間長短有關(guān)系，且通過引物篩選、反應(yīng)時間優(yōu)化能很大程度上降低其產(chǎn)生幾率，但這無疑影響了LAMP法作為檢測診斷技術(shù)的可靠性，限制了技術(shù)的臨床推廣。

3.2 與其他方法聯(lián)合應(yīng)用 近年衍生出的多重LAMP擴增技術(shù)——微型擴增技術(shù)，以其實現(xiàn)多個平行、互不干擾的小體積單重擴增的技術(shù)優(yōu)勢成為研究熱點，這些技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用ELISA[28]、熒光免疫[29]、化學(xué)發(fā)光[30]等免疫方法，具有試劑消耗少、自動化程度較高、交叉污染風(fēng)險更小以及更適合對較多靶標(biāo)進(jìn)行現(xiàn)場快速檢測。如Ge等[31]將LFD用于LAMP產(chǎn)物檢測時，利用FITC和生物素基團(tuán)分別標(biāo)記兩對環(huán)引物和固相抗體，通過顯色反應(yīng)判斷結(jié)果。這種方法操作簡單快速，提高特異性和靈敏度，但需要開管暴露擴增產(chǎn)物，易造成擴增產(chǎn)物污染，且引物的標(biāo)記會提高檢測成本，適用性不大。2011年Wang等[23]將磁珠芯片與LAMP整合，在1h內(nèi)成功檢測出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)。Mei-Feng Lee[32]等基于LAMP方法聯(lián)合PCR、ELISA和熔解曲線分析法設(shè)計了LAMP-TMELISA法對結(jié)核桿菌的多個耐藥基因突變位點進(jìn)行檢測，確定多重耐藥結(jié)核桿菌（MDR M.tuberclosis），從而指導(dǎo)臨床用藥。

3.3 應(yīng)用前景 目前，LAMP檢測技術(shù)已經(jīng)實現(xiàn)產(chǎn)品化，日本Eiken公司網(wǎng)站已經(jīng)開發(fā)了包括禽流感、SARS、西尼羅河病毒、牛胚胎性別檢測等19種LAMP檢測產(chǎn)品試劑盒出售。我國也已有十幾種LAMP檢測試劑盒開發(fā)成功并申請了專利[33-38]。試劑盒的國產(chǎn)化和商業(yè)化可建立起更低廉的檢測體系，進(jìn)一步技術(shù)的推廣和普及。雖然受到引物設(shè)計、假陽性擴增等方面的限制，LAMP在臨床推廣能力上不甚樂觀，但仍具有廣闊的應(yīng)用前景。在現(xiàn)今研究的基礎(chǔ)上，各領(lǐng)域可以聯(lián)合其他技術(shù)方法對LAMP擴增過程進(jìn)行優(yōu)化，同時針對特異性擴增產(chǎn)物建立起更加有效的檢測方法。未來，LAMP將有望成為常規(guī)的基因擴增方法，并逐步推廣到臨床。