基于生物光譜技術(shù)的污染物毒性效應(yīng)研究進(jìn)展

徐笠，蔚青,3，李君逸，韓麗花,3，殷敬偉，陸安祥,*

1. 北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究中心，北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京100097 2. 農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境監(jiān)測北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097 3. 中北大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，太原 030051 4. 清華大學(xué)摩擦學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084

應(yīng)用生物光譜技術(shù)研究污染物毒性效應(yīng)是毒理學(xué)研究中的一個(gè)新興領(lǐng)域。最常用的生物光譜技術(shù)包括紅外光譜技術(shù)(Infrared spectrometry)和拉曼光譜技術(shù)(Raman Spectroscopy)[1-2]。紅外光譜技術(shù)進(jìn)行生物樣品的無損分析是一個(gè)快速發(fā)展的研究領(lǐng)域，而且生物大分子在構(gòu)型和構(gòu)象上的變化可以用來表征環(huán)境污染物對(duì)生物細(xì)胞、組織或者器官上的毒性效應(yīng)，因此運(yùn)用紅外光譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)的手段，不僅可以靈敏、有效地評(píng)價(jià)污染物的毒性效應(yīng)，還可以快速、準(zhǔn)確地推斷其毒性作用機(jī)制[3-4]。拉曼光譜學(xué)是一種強(qiáng)大的、非侵入性的、高通量的方法，它被用來在樣本中產(chǎn)生化學(xué)實(shí)體的光譜代表，并且能夠檢測細(xì)胞的變化[5-6]。拉曼光譜是散射光譜，而紅外光譜則是吸收光譜，但兩者均是研究分子振動(dòng)的重要手段。紅外和拉曼光譜在污染物毒性效應(yīng)研究中具有靈敏度較高、檢測時(shí)間短、儀器操作簡單、所得生物信息豐富、光譜信息特征性較強(qiáng)和樣品前處理簡單且不造成二次污染等優(yōu)勢，并且應(yīng)用范圍非常廣泛，在細(xì)胞、組織和微生物等方面都可以應(yīng)用，且呈現(xiàn)出其獨(dú)特的優(yōu)勢[7-11]。本文簡要介紹了這2種技術(shù)的原理以及數(shù)據(jù)處理流程，重點(diǎn)介紹了這2種光譜技術(shù)在污染物毒性效應(yīng)研究中的進(jìn)展情況，并對(duì)未來主要的研究方向進(jìn)行了展望。

1 生物光譜法概述(Overview of biospectroscopy)

生物光譜學(xué)是光譜技術(shù)在生物檢測分析中的應(yīng)用，該技術(shù)不僅可以獲得樣品形態(tài)學(xué)上的結(jié)果，而且可以得到元素或分子層面的信息，成為一個(gè)新的領(lǐng)域?qū)W科。生物光譜法包括紅外光譜法、拉曼光譜法、熒光光譜法和X射線光譜法。目前，國內(nèi)外研究學(xué)者主要是利用紅外光譜法和拉曼光譜法2種方法在污染物毒性效應(yīng)方面開展了一系列研究。

1.1 紅外光譜

圖1 紅外吸收和拉曼散射分子振動(dòng)原理Fig. 1 Molecular vibration principle of infrared absorption and Raman scattering

1.2 拉曼光譜

拉曼是一種單色光源的光子被吸收并釋放回來

后，分子的振動(dòng)能量也隨之增加和減少的散射技術(shù)。通常情況下，有時(shí)分子不會(huì)返回到它原來的能量狀態(tài)，為了保持能量平衡，在釋放的光子中會(huì)發(fā)生頻率偏移。這種位移現(xiàn)象稱為非彈性散射或拉曼散射(圖1)[26]。散射分為瑞利散射與拉曼散射2種，拉曼散射包括斯托克拉曼散射(散射光頻率小于入射光頻率)和反斯托克拉曼散射(散射光頻率大于入射光頻率)，斯托克的強(qiáng)度遠(yuǎn)大于反斯托克的強(qiáng)度，在樣品分子的拉曼光譜測試中都是以斯托克散射峰為檢測峰，忽略反斯托克散射的信號(hào)[27]。拉曼強(qiáng)度、拉曼頻移以及線寬都可以反映出拉曼樣品池中樣品物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，與物質(zhì)分子的化學(xué)鍵、官能團(tuán)的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)有關(guān)。拉曼光譜可分為普通拉曼光譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜，在使用普通拉曼光譜時(shí)，經(jīng)常會(huì)遇到強(qiáng)烈的熒光背景(固有的或雜質(zhì)引起的)，這會(huì)降低光譜的質(zhì)量，并對(duì)信噪比(S/N)產(chǎn)生不利影響[28]。表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)由于其增強(qiáng)拉曼橫截面的性質(zhì)，可以提供強(qiáng)烈的光譜，并幫助我們克服普通拉曼的這些缺點(diǎn)[29]。為生物研究中的應(yīng)用提供了一種快速、高靈敏度的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息檢測工具[30-32]。通常，在生物樣本中觀察到的拉曼光譜的重要區(qū)域在400～2 000 cm-1波數(shù)內(nèi)，與蛋白質(zhì)(1 500～1 700 cm-1)、碳水化合物(470～1 200 cm-1)、磷酸基團(tuán)DNA(980、1 080和1 240 cm-1)和其他細(xì)胞生物分子的鍵合振動(dòng)相關(guān)。在更高的波數(shù)(2 700～3 500 cm-1)中也可以觀察到與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)中的CH、NH和OH對(duì)應(yīng)的更高頻率的伸縮振動(dòng)峰[33]。

表1 紅外和拉曼光譜的原理、特點(diǎn)及差異Table 1 Principle, characteristic and difference of Infrared Spectroscopy and Raman Spectroscopy

拉曼光譜和紅外光譜類似，同樣可以對(duì)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行定量、定性分析，不同的拉曼峰對(duì)應(yīng)了不同的官能團(tuán)，與紅外相比拉曼的一個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)是：水分對(duì)生物指紋區(qū)的拉曼信號(hào)沒有影響，因此拉曼光譜還可以用于活體成像。此外，受限于紅外光的波長衍射極限，紅外光譜顯微鏡的空間分辨率受限，一般都是微米級(jí)別以上的，而拉曼光譜可以使用短波長的激光器做激發(fā)，并結(jié)合共聚焦顯微系統(tǒng)，可以達(dá)到百納米級(jí)別的空間分辨率。紅外和拉曼光譜的特點(diǎn)及差異詳見表1。

2 生物光譜數(shù)據(jù)處理方法(Biospective data processing method)

通常生物光譜實(shí)驗(yàn)采集復(fù)雜生物化學(xué)信息數(shù)據(jù)集的成百上千個(gè)差異細(xì)微的圖譜，而且由于生物樣本本身的復(fù)雜性使得圖譜中存在著很多的譜峰重疊性，因此需利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)圖譜進(jìn)行分析。光譜數(shù)據(jù)分析大致分為3個(gè)部分：光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理、提取光譜信息特征、以及信息分類和光譜特征峰解析(圖2)，可以利用一些軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理(表2)。

2.1 光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理

預(yù)處理旨在提高后續(xù)多變量分析的穩(wěn)健性和準(zhǔn)確性，并通過糾正與光譜數(shù)據(jù)采集相關(guān)的問題來提高數(shù)據(jù)的可解釋性。光譜數(shù)據(jù)前處理包括剔除異常值、剪切、降噪、基線校正以及歸一化[34]。在某些情況下，光譜的目視檢查顯示出明顯的異常值，包括大量的光譜污染、熒光或非常差的S/N，可以要剔除這些明顯的異常值。樣品制備、背景熒光以及電荷耦合器件的熱波動(dòng)會(huì)產(chǎn)生噪聲和影響光譜基線。因此，需要降低噪聲和基線校正以提高光譜質(zhì)量，降噪和基線校正的第一種方法就是改變樣品制備方法以及光譜儀器的采集設(shè)置，其次還可以通過一些相應(yīng)的方法進(jìn)行處理。比如常用的基線校正、降噪處理方法包括直接基線校正(rubber-band correction)、多項(xiàng)式擬合基線校正(polynomial-correction)、一階微分(1st order differentiation)、小波降噪(wavelet-deniose)，其中直接基線校正常用于譜圖背景相對(duì)簡單的情形中，多項(xiàng)式擬合主要針對(duì)于復(fù)雜背景條件下的基線校正，常用于拉曼譜圖的校正，但是存在一定誤差，一階微分的方法則適用于復(fù)雜譜圖背景條件下，例如像包含熒光背景的拉曼譜圖，但是也會(huì)引入過多的噪音，而小波降噪則正好適用于含大量噪音信號(hào)成分的譜圖中，進(jìn)行降噪處理[35]。歸一化紅外和拉曼光譜至關(guān)重要，以解決混淆因素，可以運(yùn)用酰胺I、酰胺II、矢量歸一化、最大-最小值歸一化、標(biāo)準(zhǔn)化和中心化等方法對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化[36]。

2.2 提取光譜信息特征

特征提取大致分為特征構(gòu)造和特征選擇2種方法。特征構(gòu)造是在數(shù)據(jù)中創(chuàng)造新特征，從而推斷出其他不太清楚的信息[37]。這對(duì)于其他同質(zhì)數(shù)據(jù)集中的診斷，生物標(biāo)記提取和模式識(shí)別尤為重要，并且它在高光譜成像中具有重要作用，因?yàn)閱蝹€(gè)像素可以減少與光譜強(qiáng)度或方差有關(guān)的單個(gè)值[38]。特征選擇是從數(shù)據(jù)集推斷現(xiàn)有特征，例如特定波數(shù)，可用于確定光譜生物標(biāo)志物和提供診斷框架。光譜信息的特征提取包括分類、回歸、聚類和降維等相關(guān)的處理方法，常用的提取方法包括主成分分析(PCA)[39]、偏最小二乘回歸(PLS)[40]、線性判別分析(LDA)[41]、支持向量機(jī)分析(SVM)[42-43]及主成分結(jié)合線性判別分析(PCA-LDA)[1]。

2.3 信息分類和光譜特征峰解析

在成像和診斷研究中，通常需要基于光譜對(duì)樣品進(jìn)行分類，因?yàn)楣庾V可以基于先前的用戶輸入(監(jiān)督分類)或單獨(dú)的光譜方差(無監(jiān)督)進(jìn)行分類。無監(jiān)督分類通常依賴于聚類技術(shù)，其中層次聚類分析，k均值聚類和模糊C均值聚類是3種常用的方法[44]，監(jiān)督分類常見的方法包括線性判別分類器(LDCs)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和支持向量機(jī)(SVMs)等[45-46]。生物樣本主要組成成分包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸和糖類等。所以解析光譜特征峰主要包括：分析脂質(zhì)特征吸收峰(烷基鏈結(jié)構(gòu)(CH2和CH3)、羰基及磷酸基團(tuán)的振動(dòng)信息)，得出與細(xì)胞膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)及膜脂過氧化程度的信息；分析蛋白質(zhì)分子相關(guān)的振動(dòng)信息主要包括酰胺I、酰胺II、游離氨基酸殘基及磷酸化蛋白相關(guān)的振動(dòng)信息；分析酰胺I的結(jié)構(gòu)可以得到蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，分析游離氨基酸可以得到細(xì)胞內(nèi)氨基酸側(cè)鏈信息及蛋白質(zhì)翻譯后修飾的信息等；分析與核酸振動(dòng)信息相關(guān)的吸收峰可以得到與DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況。

3 生物光譜法應(yīng)用研究進(jìn)展(Progress in the application of biospectroscopy)

3.1 紅外光譜在污染物毒性效應(yīng)研究進(jìn)展

3.1.1 細(xì)胞毒性效應(yīng)研究進(jìn)展

表2 紅外和拉曼光譜數(shù)據(jù)分析軟件Table 2 Data analysis software for Infrared spectroscopy and Raman spectrum

上述研究大都側(cè)重于單一污染物在同一細(xì)胞周期的毒性效應(yīng)，也有部分研究開展了同一污染物對(duì)處于不同周期細(xì)胞的毒性效應(yīng)以及復(fù)合污染的細(xì)胞毒性效應(yīng)，如Li等[51]運(yùn)用ATR-FTIR研究了不同類型碳納米材料(C60、長多壁碳納米管、短多壁碳納米管)的細(xì)胞毒性效應(yīng)，結(jié)果表明：G0/G1期細(xì)胞的抗氧化酶的活性要高于S期，G0/G1期細(xì)胞對(duì)這3種碳納米材料的毒性效應(yīng)更加敏感。Li等[4]將魚鰓細(xì)胞和MCF-7共同暴露在C60和苯并芘環(huán)境下，然后用顯微傅立葉變換紅外光譜法(Micro-FTIR)分析這2種細(xì)胞的生物結(jié)構(gòu)信息。結(jié)果顯示低濃度C60可以促進(jìn)苯并芘對(duì)細(xì)胞的氧化損傷，高濃度C60卻減弱這種影響效果；盡管低濃度C60可以促進(jìn)苯并芘氧化損傷水平，但是若這2種物質(zhì)共同處理細(xì)胞，卻減弱了任一種污染物單獨(dú)誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷水平。Llabjani等[52]運(yùn)用ATR-FTIR研究多氯聯(lián)苯和多溴二苯醚對(duì)MCF-7的復(fù)合毒性作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過相似調(diào)節(jié)機(jī)制作用的不同污染物可能產(chǎn)生抑制作用，而具有獨(dú)立作用機(jī)制的污染物可能增強(qiáng)該毒性作用。

3.1.2 植物毒性效應(yīng)研究進(jìn)展

紅外光譜在植物毒性效應(yīng)方面的研究主要集中在浮萍和藻2種植物上。Hu等[14]使用FTIR結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)的方法監(jiān)測4種化學(xué)物質(zhì)(Cu、Cd、阿特拉津和乙草胺)和4種金屬工業(yè)廢水對(duì)浮萍的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA/RNA和碳水化合物等生物化學(xué)分子變化的影響情況，從而鑒定其對(duì)浮萍的毒性效應(yīng)，結(jié)果表明以光譜信息為工具的毒性評(píng)價(jià)方法不但準(zhǔn)確、可靠，而且能夠提供多效應(yīng)終點(diǎn)的評(píng)價(jià)結(jié)果。Xin等[53]利用SR-FTIR研究了三氯生和卡馬西平對(duì)綠藻的毒性機(jī)制，結(jié)果顯示三氯生對(duì)綠藻的毒性要強(qiáng)于卡馬西平。三氯生通過抑制脂肪酸合成進(jìn)而影響蛋白質(zhì)合成，這種毒性作用在高濃度(100 μmol·L-1)下是不可逆轉(zhuǎn)的，但是隨著時(shí)間的延長它的濃度會(huì)減弱到0.391 μmol·L-1；卡馬西平可以產(chǎn)生疏水性的相互作用，影響磷脂雙層結(jié)構(gòu)，并對(duì)特定的蛋白質(zhì)起作用，使細(xì)胞膜失去功能。但是在延長暴露時(shí)間的同時(shí)，暴露在卡馬西平下的綠藻細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生耐藥性。Dao等[54]利用ATR-FTIR研究了Pb對(duì)2種綠藻(小球藻和柵藻)的毒性效應(yīng)，結(jié)果表明：在Pb暴露條件下，綠藻的多糖和脂質(zhì)含量增加，但是蛋白質(zhì)和磷酸分子含量減少，紅外光譜所表現(xiàn)的結(jié)果與光合參數(shù)與常規(guī)脂質(zhì)測定的結(jié)果相吻合。

3.1.3 動(dòng)物毒性效應(yīng)研究進(jìn)展

Li等[55]將斑馬魚分別暴露于C60、長多壁碳納米管、短多壁碳納米管和單壁碳納米管21 d，ATR-FTIR結(jié)果顯示：高劑量的碳納米材料(CNPs)對(duì)斑馬魚的鰓和大腦的毒性更大，而低劑量的CNPs對(duì)性腺和肝臟的毒性更強(qiáng)；CNPs對(duì)斑馬魚的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA/RNA產(chǎn)生顯著變化；腦和性腺對(duì)CNPs的響應(yīng)更敏感，與對(duì)照組相比，長多壁碳納米管對(duì)大腦中脂質(zhì)與蛋白質(zhì)的比值沒有明顯的影響，而C60、短多壁碳納米管和單壁碳納米管會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)與蛋白質(zhì)的比率顯著升高，CNPs對(duì)雄性大腦的DNA/RNA光譜區(qū)域的影響比雌性更大。CNPs對(duì)大腦的干擾可能擾亂下丘腦-垂體-性腺軸，并進(jìn)一步影響性腺；所以CNPs對(duì)斑馬魚具有一定的神經(jīng)毒性和生殖毒性。Anusha等[56]將老鼠每天吸入蚊香8 h并持續(xù)30 d，結(jié)果顯示蚊香對(duì)老鼠的肝、腎、肺、心、腦等多種組織和功能有損傷情況。與對(duì)照組相比，吸入蚊香的老鼠肝臟、腎臟、肺和大腦中的生物大分子都發(fā)生了變化，主要表現(xiàn)在蛋白質(zhì)和脂質(zhì)相關(guān)振動(dòng)峰降低。生物大分子改變程度在老鼠的肝臟和腎臟最顯著，接下來是肺和大腦。Palaniappan和Pramod[57]利用FTIR研究了二氧化鈦納米粒子及其塊狀材料對(duì)斑馬魚大腦生化成分的影響，研究結(jié)果顯示：納米二氧化鈦的毒性要強(qiáng)于其他塊狀材料；與對(duì)照組相比，暴露在二氧化鈦下的斑馬魚，其大腦組織中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生化成分都發(fā)生了改變。大腦組織中脂質(zhì)被氧化，導(dǎo)致羰基化物增加，因此羰基與-CH2的峰積分面積比升高，進(jìn)一步證明大腦生化成分的改變主要是因?yàn)榛钚匝醯倪^量產(chǎn)生。Prabha等[58]從印度泰米爾納德北部的池塘收集了南亞野鯪，然后以不同含量的黑藻為魚飼料，研究這種淡水魚的鉛毒性試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)比鉛中毒和不同濃度黑藻處理過的魚骨樣品，魚骨中的蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)的頻帶面積和峰強(qiáng)都有顯著變化。當(dāng)南亞野鯪喂含20%黑藻的飼料，其魚骨的鉛含量顯著降低，說明黑藻具有對(duì)南亞野鯪骨組織中鉛誘導(dǎo)毒性的抗骨質(zhì)疏松作用。

3.1.4 微生物毒性效應(yīng)研究進(jìn)展

Riding等[59]運(yùn)用FTIR研究了碳納米材料對(duì)革蘭氏陰性菌的毒性效應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)C60、長多壁碳納米管、短多壁碳納米管和單壁碳納米管都導(dǎo)致細(xì)菌的脂質(zhì)、酰胺II的DNA改變，改變程度隨納米粒子大小而不同，短多壁碳納米管比長多壁碳納米管毒性更強(qiáng)，C60毒性最小。相比于其他，而C60所表現(xiàn)出的光譜信息差異最顯著，且主要表現(xiàn)在蛋白質(zhì)方面。Gupta等[60]利用紅外光譜法研究了重金屬Ni和Cr對(duì)大腸桿菌的毒性的相互作用，結(jié)果表明Ni(II)對(duì)大腸桿菌的親和性要強(qiáng)于Cr(VI)，因?yàn)樗赡軙?huì)侵入到大腸桿菌蛋白質(zhì)的S層，所以它對(duì)大腸桿菌的毒性也要強(qiáng)于Cr。并且隨著Ni的不斷加入，會(huì)導(dǎo)致Cr對(duì)大腸桿菌的毒性增強(qiáng)，二者表現(xiàn)為協(xié)同作用。Ni會(huì)使大腸桿菌的脂質(zhì)含量降低，在3 000～2 800 cm-1和～1 455 cm-1的頻帶峰面積減小，所以比較脂質(zhì)譜帶面積可以去監(jiān)測金屬毒性而導(dǎo)致的脂肪酸變化。Heys等[61]使用ATR-FTIR和SR-FTIR光譜研究碳納米材料(CBNs)對(duì)革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌的影響。結(jié)果顯示革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌在接觸CBNs時(shí)表現(xiàn)出不同的變化。革蘭氏陽性細(xì)菌對(duì)這些材料表現(xiàn)出更強(qiáng)的抵抗力，這可能是由于它有更堅(jiān)固的細(xì)胞壁來維持其完整性，但是在接觸CBNs后革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌的酰胺II都發(fā)生了變化。SR-FTIR因其高分辨率能夠提供反映納米毒性變化的詳細(xì)的、深入的信息，而ATR-FTIR光譜學(xué)則提供了被CBNs誘導(dǎo)所導(dǎo)致的細(xì)菌改變細(xì)節(jié)的合理概述。

上述研究已表明，紅外光譜技術(shù)(FTIR、ATR-FTIR和micro-FTIR)可以廣泛用于不同污染物對(duì)不同生物的毒性效應(yīng)研究之中，這些技術(shù)有著各自的優(yōu)缺點(diǎn)，如ATR-FTIR在這3種測定方法中是最靈敏的，但是該方法測定會(huì)破壞樣品，而且比較耗時(shí)；micro-FTIR靈敏度沒有ATR-FTIR高，但是可以不破壞樣品，并且可以進(jìn)行面掃描。因此，在運(yùn)用這些紅外技術(shù)研究污染物毒性效應(yīng)時(shí)，需根據(jù)研究目的和樣品選擇合適的方法。

3.2 拉曼光譜在污染物毒性效應(yīng)的研究進(jìn)展

拉曼光譜技術(shù)是以拉曼散射效應(yīng)為基礎(chǔ)，以光子為探針，具有實(shí)時(shí)在線分析、無損快速檢測等優(yōu)秀特點(diǎn)的分子結(jié)構(gòu)表征技術(shù)。近年來，拉曼光譜可以提供生物分子指紋圖譜，如蛋白質(zhì)、DNA、脂類以及氨基酸、嘌呤等代謝中間產(chǎn)物的信息，因此能夠從分子水平上研究污染物的毒性效應(yīng)。

3.2.1 常規(guī)拉曼光譜

Li等[62]利用拉曼光譜研究了C60、長多壁碳納米管、短多壁碳納米管3種碳納米材料對(duì)MCF-7的毒性效應(yīng)，結(jié)果表明：這3種納米材料均造成了胱氨酸和蛋白質(zhì)比值的升高，其中短多壁碳納米管暴露造成的胱氨酸和蛋白質(zhì)比值最高，胱氨酸和蛋白質(zhì)比值增加與活性氧含量增加是成比例的，因此，也說明了短多壁碳納米管造成了活性氧含量升高的幅度最大。林凡佳等[63]使用拉曼光譜分析不同濃度的凋亡誘導(dǎo)劑(黃連素)對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)內(nèi)吞Si納米粒子在520 cm-1的特征拉曼峰的平均信號(hào)強(qiáng)度，表征細(xì)胞內(nèi)吞Si納米粒子的能力。結(jié)果表明，隨著黃連素濃度的增加，細(xì)胞對(duì)Si納米粒子的內(nèi)吞能力減弱，原因是HepG2細(xì)胞凋亡過程中線粒體的活性不斷減弱，導(dǎo)致能量代謝受阻。Neugebauer等[64]采用拉曼光譜發(fā)現(xiàn)抗生素環(huán)丙沙星導(dǎo)致短小芽胞桿菌蛋白質(zhì)峰減弱和核酸峰增強(qiáng)，從而認(rèn)為環(huán)丙沙星能夠結(jié)合rRNA，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)的合成和核酸含量的增加。Li等[55]將斑馬魚分別與C60、長多壁碳納米管、短多壁碳納米管和單壁碳納米管接觸21 d，然后用拉曼光譜分析了斑馬魚的大腦和性腺中的不飽和脂質(zhì)含量(C=C和CH2的比例)，結(jié)果顯示經(jīng)過處理的斑馬魚的脂質(zhì)與對(duì)照組的斑馬魚差異很明顯，其中雄性斑馬魚中不飽和脂質(zhì)含量要高于雌性。趙晶[65]利用拉曼光譜研究了4-壬基酚對(duì)大鼠睪丸組織的影響，結(jié)果表明：4-壬基酚暴露組與對(duì)照組之間有顯著性差異(P<0.001)，主要表現(xiàn)在脂質(zhì)與蛋白質(zhì)比率和不飽和脂肪水平等方面。

3.2.2 表面增強(qiáng)拉曼光譜

與常規(guī)拉曼相比，SERS可以使接近或吸附于金、鋁和銀等粗糙金屬表面或者納米結(jié)構(gòu)(如等離子體磁性二氧化硅納米管[66])的分子的拉曼信號(hào)增強(qiáng)，其信號(hào)比常規(guī)拉曼散射增強(qiáng)106～1014倍[67]。SERS可以極大地提高拉曼信號(hào)強(qiáng)度、縮短采譜時(shí)間和淬滅熒光干擾，有效地解決常規(guī)拉曼所遇到的問題。Cui等[68]利用SERS研究了Ag對(duì)大腸桿菌的毒性，結(jié)果表明在Ag納米粒子的作用下大腸桿菌的蛋白質(zhì)、次黃嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤核苷拉曼光譜帶會(huì)發(fā)生變化，其主要原因是Ag納米粒子影響嘌呤的代謝和蛋白質(zhì)的合成過程，并且粒徑小的Ag納米粒子要比大的毒性更大。Zhang等[69]借助無納米毒性和高SERS活性納米金方法，研究了不同濃度納米ZnO(0、0.6、3、15、60、240、480 mg·L-1)作用于大腸桿菌不同時(shí)間(0.5、1.5、3、6、12、24 h)后細(xì)菌的特征生物變化和毒性動(dòng)力學(xué)過程。結(jié)果表明，納米ZnO的毒性機(jī)制在于產(chǎn)生活性氧基團(tuán)，導(dǎo)致?lián)p傷核酸和改變了膜的通透性，而細(xì)菌通過合成相關(guān)的防御蛋白來降低這種不利影響。納米Zn在0.5 h即可發(fā)揮毒性作用，且低劑量長期暴露能夠發(fā)揮與高劑量暴露相同的毒性作用。Walter等[5]通過使用SERS研究金屬納米粒子對(duì)鏈霉菌的毒性效應(yīng)，結(jié)果顯示隨著Ni2+濃度的增加鏈霉菌中蛋白質(zhì)(1 660和1 448 cm-1)的峰的相對(duì)強(qiáng)度增加，而DNA(1 574和1 480 cm-1)的峰強(qiáng)在減弱。El-Zahry等[70]研究了Ag納米粒子對(duì)細(xì)菌的毒性效應(yīng)，再次證明Ag納米粒子的抗菌機(jī)制是影響嘌呤的代謝進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)的合成。并且通過SERS譜圖分析發(fā)現(xiàn)，Ag納米粒子的粒徑和濃度對(duì)細(xì)菌的抗菌性能影響最大。Cui等[71]利用拉曼光譜研究重金屬As(V)和四環(huán)素對(duì)細(xì)菌的毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)As(V)和四環(huán)素之間是交互抗性，As(V)在增強(qiáng)細(xì)菌耐藥性的同時(shí)阻止四環(huán)素起作用。Lu等[72]借助SERS和FTIR能夠預(yù)測細(xì)胞損傷類型和程度，然后深入了解大蒜萃取物和二烯丙基硫化物的抗菌機(jī)理。Li等[62]利用SERS分析了0.1 mg·L-1、0.01 mg·L-1和0.001 mg·L-1的C60、長多壁碳納米管、短多壁碳納米管和單壁碳納米管對(duì)A549肺細(xì)胞的毒性效應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)這些碳基納米離子會(huì)導(dǎo)致A549肺細(xì)胞的DNA甲基化水平增強(qiáng)，這也是首次發(fā)現(xiàn)納米粒子會(huì)改變細(xì)胞的甲基化水平。

拉曼光譜主要是針對(duì)非極性分子的檢測，而紅外光譜主要是針對(duì)極性分子的檢測，因此2種之間是互補(bǔ)的關(guān)系。此外，和紅外光譜相比，拉曼光譜在污染物毒性效應(yīng)方面的研究較少，但是拉曼光譜所蘊(yùn)含的信息更加豐富，應(yīng)著重發(fā)展拉曼光譜在污染物毒性效應(yīng)方面的應(yīng)用。

4 研究展望(Research outlook)

(1)加強(qiáng)將紅外和拉曼光譜有機(jī)聯(lián)合應(yīng)用，目前將兩者聯(lián)合用于污染物毒性效應(yīng)的研究較少。因?yàn)樵S多在紅外光譜中較弱的波段是拉曼光譜中最強(qiáng)的波段，所以在污染物毒性效應(yīng)研究中各有各的優(yōu)勢，可以互補(bǔ)。通過有機(jī)地結(jié)合紅外和拉曼光譜的測定結(jié)果，能更好地反映污染物的毒性效應(yīng)。

(2)拓展紅外和拉曼光譜污染物毒性效應(yīng)研究的應(yīng)用范圍。一方面是樣品類型的拓展，如在植物應(yīng)用領(lǐng)域，目前基本上只運(yùn)用在綠藻和浮萍等植物中，應(yīng)進(jìn)一步拓展到高等植物(農(nóng)作物、蔬菜等)上；另一方面是目標(biāo)污染物的拓展，如微塑料等新型污染物的研究。

(3)相對(duì)于紅外光譜而言，目前拉曼光譜的應(yīng)用較少，特別是表面增強(qiáng)拉曼光譜的應(yīng)用，拉曼光譜中所含有的生化特征要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于紅外光譜，因此，發(fā)展新的表面增強(qiáng)技術(shù)，特別是具有特異性指標(biāo)的表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)，將是一個(gè)重要的研究方向。

(4)目前的研究大都側(cè)重于單一污染物的研究，但是環(huán)境中的污染大都以復(fù)合污染的形式存在，因此，應(yīng)加強(qiáng)將生物光譜技術(shù)應(yīng)用于復(fù)合污染的研究之中。