郄明麗，李志慧，張偉偉，高言，馮志遠(yuǎn)，張建海,*

1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801 2. 生態(tài)畜牧與環(huán)境獸醫(yī)學(xué)山西省重點實驗室，太谷 030801

近年來，伴隨著納米技術(shù)的興起和快速發(fā)展，納米材料被廣泛應(yīng)用，其中納米碳管(carbon nanotubes, CNTs)是最常見的納米材料之一，在生物化學(xué)、制藥和電子應(yīng)用等領(lǐng)域都擁有廣闊的前景[1-3]。同時，由于納米材料尺寸微小，并可通過口腔或呼吸道進(jìn)入生物體，其對人和動物的安全性廣受關(guān)注。有研究顯示，表觀分子量高達(dá)60萬的羥基化水溶性CNTs可以在小鼠的不同器官之間自由穿梭，并通過尿液排出體外[4]。然而目前羧基化多壁碳納米管(MWCNTs-COOH)對于生殖系統(tǒng)尤其是雌性生殖系統(tǒng)的影響尚不明確。

本研究采用水溶性較好的羧基化多壁碳納米管為研究對象，基于成年雌性小鼠的卵巢病理學(xué)，將不同劑量(2.5, 5, 10 mg·kg-1)的羧基化多壁碳納米管溶液連續(xù)給予實驗小鼠灌胃64 d，觀察卵巢組織形態(tài)學(xué)變化，評價MWCNTs-COOH對雌性小鼠卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

羧基化多壁碳納米管(MWCNTs-COOH)，購自南京先豐納米材料科技有限公司。8周齡雌性SD昆明小鼠，體重(31±2) g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 MWCNTs-COOH的制備與表征

MWCNTs-COOH的純度>95%，羧基質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.23%，平均直徑為20～30 nm，長度為0.2～2 μm。使用酸洗法除去MWCNTs-COOH表面的鐵催化劑。將10 mg MWCNTs-COOH溶入H2SO4/HNO3濃度比為3:1的40 mL混合液中，將其倒入100 mL錐形瓶中，于40～50 ℃水中超聲震蕩24 h。此后，使用去離子水將懸浮液稀釋至400 mL，并用0.22 μm聚酸脂膜過濾膜過濾，重復(fù)洗3次。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組及染毒

8周齡雌性SD昆明小鼠40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分成4組，每組10只。給予對照組含0.5% Tween-20的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，試驗組分別給予濃度為2.5, 5, 10 mg·kg-1MWCNTs-COOH(溶于0.5% Tween-20的PBS溶液)，連續(xù)灌胃64 d。整個試驗期間，保證所有小鼠自由飲水，保持鼠房安靜、空氣流通和溫度濕度適中的整體環(huán)境，最大限度降低除MWCNTs-COOH外的其他因素的影響。

1.3.2 小鼠生長發(fā)育情況觀察

MWCNTs-COOH處理期間，每天對實驗小鼠的精神狀況和飲水采食情況進(jìn)行觀察，每周進(jìn)行一次稱重，并詳細(xì)記錄。

表1 各級卵泡的形態(tài)特征Table 1 Morphology of the follicles at different stages

1.3.3 卵巢組織超微結(jié)構(gòu)觀察

MWCNTs-COOH處理小鼠64 d后，按100 g體質(zhì)量0.7 mL腹腔注射20%烏拉坦麻醉，迅速剖開小鼠，以37 ℃生理鹽水對小鼠進(jìn)行心臟灌流。灌流結(jié)束后迅速對小鼠右側(cè)卵巢進(jìn)行前固定、漂洗、后固定、脫水、浸透、包埋、聚合、修整、切片、展片、染色等一系列步驟后，擺放在干凈的濾紙上，自然干燥后置于透射電子顯微鏡下觀察，以確定碳納米管是否進(jìn)入卵泡。

1.3.4 小鼠卵巢組織病理學(xué)觀察

小鼠灌流過程同上。取左側(cè)卵巢放入Bouin液中固定，12 h后，放入70%酒精中，換液2～3次，洗去淡黃色苦味酸。此后，依次用80%、85%、90%(2次)、100%(2次)梯度酒精進(jìn)行組織脫水，再用二甲苯使組織透明，最后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋。繼而采用常規(guī)HE染色，制作石蠟切片，并應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察卵巢組織的病理學(xué)變化。

雌性哺乳動物出生時卵巢的原始卵泡儲備是有限的。在生長和發(fā)育過程中，原始卵泡的數(shù)目不斷減少，只有極少數(shù)可以發(fā)育到成熟階段排出體外；反之，停止生長，形成閉鎖卵泡。根據(jù)卵泡發(fā)育過程的形態(tài)和功能變化，可分為原始卵泡(primordial follicles)、初級卵泡(primary follicle)、次級卵泡(secondary follicle)和成熟卵泡(mature follicle)4個階段。不具備生長優(yōu)勢的卵泡在發(fā)育進(jìn)程中形成閉鎖卵泡(atretic follicle)。成熟卵泡排除體內(nèi)后殘留的卵泡壁塌陷，卵泡膜的結(jié)締組織、毛細(xì)血管等伸入到顆粒層，迅速轉(zhuǎn)變成的富有血管的腺體樣結(jié)構(gòu)即黃體(corpus luteum)(表1)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用GraphPad Prism5統(tǒng)計軟件的one-way analysis of variance (ANOVA)方法進(jìn)行T檢驗分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 試驗小鼠一般情況觀察

在整個試驗過程中，各組小鼠均未出現(xiàn)非正常

死亡，對照組小鼠活動正常，被毛光亮，飲食正常。此外，試驗初期各組小鼠有輕度的煩躁，后期出現(xiàn)食欲降低、精神沉郁、活動減少、飲水減少的情況，且10 mg·kg-1組較為明顯，2.5 mg·kg-1和5 mg·kg-1組小鼠無明顯臨床癥狀。各劑量組雌鼠體重動態(tài)觀測結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，小鼠體重在各時間段無顯著變化，卵巢的臟體系數(shù)也沒有顯著變化(表2)。

2.2 卵巢的超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

圖2為透射電子顯微鏡下的卵巢組織超微結(jié)構(gòu)代表圖，可見5 mg·kg-1組和10 mg·kg-1組卵巢組織中存在羧基化多壁碳納米管的聚集。

2.3 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察分析

卵巢組織切片經(jīng)HE染色后用光學(xué)顯微鏡于40倍物鏡下觀察(圖3)，卵巢的皮質(zhì)含有較多原始卵泡，結(jié)締組織中含有梭形基細(xì)胞，走向不規(guī)則，無彈性纖維，膠原纖維較少，網(wǎng)狀纖維多。髓質(zhì)中含有較多疏松結(jié)締組織，彈性纖維豐富，其中含有許多大的血管，卵泡較少。

圖1 羧基化多壁碳納米管(MWCNTs-COOH)對雌性小鼠體重的影響(n=10, mean±SD)Fig. 1 Effects of carboxylation functionalized multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs-COOH) on the body weight of female mice (n=10, mean±SD)

表2 不同劑量MWCNTs-COOH暴露下雌性小鼠卵巢臟器系數(shù)(g/g,%) (mean±SD)Table 2 The ovarian organ coefficients of female mice exposed to MWCNTs-COOH at different doses (g/g,%) (mean±SD)

圖2 5 mg·kg-1和10 mg·kg-1劑量組小鼠卵巢超微結(jié)構(gòu)注：箭頭所指為碳納米管。Fig. 2 Ultrastructure of mice ovary at 5 mg·kg-1 and 10 mg·kg-1 dose groupNote: The arrow indicates the carbon nanotubes.

圖3 MWCNTs-COOH對小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)的影響注：A原始卵泡對比；B初級卵泡對比；C次級卵泡對比；D閉鎖卵泡對比。GE，生殖上皮；PF，原始卵泡；PyF，初級卵泡； PO，初級卵母細(xì)胞；FC，卵泡細(xì)胞；SF，次級卵泡；FA，卵泡腔；CO，卵丘；SG，顆粒層；CR，放射冠；AF，閉鎖卵泡。Fig. 3 Effects MWCNTs-COOH on morphological changes of mouse ovaryNote: A, Comparison of primordial follicles; B, Comparison of primary follicle; C, Comparison of secondary follicle; D, Comparison of atretic follicle. GE, germinal epithelium; PF, primordial follicle; PyF, primary follicle; PO, primary oocyte; FC, follicular cell; SF, secondary follicle; FA, follicular antrum; CO, cumulus oophorus; SG, stratum granulosum; CR, corona radiate; AF, atretic follicle.

圖4 MWCNTs-COOH對雌性小鼠卵泡數(shù)目的影響注：*表示差異顯著(P<0.05)；***表示差異極顯著(P<0.001)。Fig. 4 Effects of MWCNTs-COOH on the number of follicles in female miceNote: *P<0.05，*** P<0.001， indicates significant difference， respectively.

從HE圖片可以看出，對照組小鼠卵巢內(nèi)原始卵泡(圖3A)、初級卵泡(圖3B)、次級卵泡(圖3C)和閉鎖卵泡(圖3D)的細(xì)胞形態(tài)正常，輪廓清晰。與對照組相比，2.5 mg·kg-1組各級卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu)基本無病理變化；5 mg·kg-1組可見卵巢組織間質(zhì)內(nèi)有少量黑色顆粒；10 mg·kg-1組各級卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu)亦無明顯病理變化。

2.4 卵泡數(shù)目檢測結(jié)果

對MWCNTs-COOH暴露下的卵巢組織的卵泡數(shù)目在10倍物鏡下進(jìn)行了計數(shù)，并應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件GraphPad Prism5對統(tǒng)計結(jié)果進(jìn)行分析(圖4)。分析結(jié)果顯示，不同劑量的MWCNTs-COOH均降低了小鼠卵巢中的卵泡數(shù)目。其中2.5 mg·kg-1組小鼠卵泡數(shù)目顯著減少(P<0.05)，5 mg·kg-1和10 mg·kg-1組小鼠卵泡數(shù)顯著減少(P<0.001)。

3 討論(Discussion)

在之前的納米毒理學(xué)研究中，Mercer等[5]發(fā)現(xiàn)CNTs顆粒容易在肺部沉積。而通過吞咽、吸入和氣管滴注等方法將小鼠暴露于CNTs后，均可引起小鼠肺臟不同程度的病理變化，嚴(yán)重時其他組織也可見不同程度的氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥和纖維化現(xiàn)象，并伴隨過敏反應(yīng)[6-7]。相比之下，經(jīng)灌胃暴露CNTs的方法則很少用于研究其毒性機(jī)制。與此同時，隨著碳納米管在生物毒性方面研究的深入，除對肺臟、肝臟等靶器官的研究外，對于其生殖毒性的研究也逐漸引起人們的重視。在對CNTs生殖毒性的研究中發(fā)現(xiàn)，雄性小鼠經(jīng)口暴露于MWCNTs后，可觀察到血清中游離睪酮水平的劑量依賴性降低及精子受精能力的顯著降低[8]。此外，腹腔注射MWCNTs后，青春期Wistar大鼠呈現(xiàn)出劑量依賴性的顯著的睪丸和附睪功能障礙[9]。并且在最近的研究中，給予雄性Wistar大鼠2和10 mg·kg-1功能化的MWCNTs(functionalized-MWCNTs, f-MWCNTs)，持續(xù)15次交替的腹膜內(nèi)劑量，觀察到精子的顯著損害，生殖上皮的變性和生殖細(xì)胞的喪失[10]。然而，對于CNTs雌性生殖毒性的研究則相對較少。因此，本實驗擬采用灌胃處理的方法，按照2.5, 5, 10 mg·kg-1劑量標(biāo)準(zhǔn)，對8周齡雌性SD昆明小鼠進(jìn)行持續(xù)64 d的MWCNTs-COOH暴露，以探究MWCNTs-COOH的雌性生殖毒性機(jī)制。

卵巢是產(chǎn)生卵子及分泌激素的器官，是雌性生殖系統(tǒng)的重要組成部分。卵巢的健康狀況可以通過卵巢標(biāo)本中各級卵泡和黃體的病理學(xué)觀察以及計數(shù)該卵巢標(biāo)本中原始、初級、次級卵泡以及閉鎖卵泡和黃體數(shù)目的算數(shù)平均值來反映。有研究表明，ICR小鼠暴露于磷酸膽堿多壁碳納米管環(huán)境中，在10 mg·kg-1劑量下，沒有發(fā)現(xiàn)任何全身毒性和組織病理學(xué)的變化[11]。暴露途徑下小鼠的卵巢組織結(jié)構(gòu)正常，各級卵泡以及成熟卵泡和黃體均未見明顯的缺失或結(jié)構(gòu)的異常[12]，表明碳納米管對于小鼠具有良好的雌性生殖相容性。此外，有研究證明低劑量的2,2-溴乙基丙二醇降低了原始卵泡和生長卵泡的數(shù)目，但是并未影響小鼠的生殖力[13]。也有研究顯示，多次暴露MWCNTs-COOH并未造成明顯的病理學(xué)改變，各級卵泡和黃體數(shù)目、子宮內(nèi)膜和肌層厚度均無顯著性變化[14]。相似地，不同劑量的MWCNTs-COOH同樣未對卵巢的形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響。同時，在對卵巢中各級卵泡的總數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計時發(fā)現(xiàn)，隨著MWCNTs-COOH劑量的加大，卵巢中卵泡總數(shù)顯著減少。

基于目前的實驗結(jié)果，在經(jīng)口腔暴露MWCNTs-COOH的情況下，卵巢卵泡的形態(tài)結(jié)構(gòu)并未受到明顯影響，提示MWCNTs-COOH可能具有良好的雌性生殖安全。但是，MWCNTs-COOH在動物生殖發(fā)育的其他階段的安全問題，仍需要進(jìn)一步研究。