彗星實驗技術及其應用

李崗，吳聲敢,2,3,4，蔡磊明,2,3,4,*

1. 浙江省農業(yè)科學院 農產品質量標準研究所,杭州 310021 2. 浙江省農業(yè)科學院 農業(yè)部農藥檢測重點實驗室,杭州 310021 3. 浙江省農業(yè)科學院 浙江省農藥殘留檢測與控制研究重點實驗室,杭州 310021 4. 浙江省農業(yè)科學院 浙江省植物有害生物防控省部共建國家重點實驗室培育基地,杭州 310021

1 發(fā)明與發(fā)展(Devised and developing comet assay)

彗星實驗(comet assay)也叫單細胞凝膠電泳實驗(single cell gel electrophoresis, SCGE)，是瑞典科學家O. Ostling和K.J. Johanson于1984年發(fā)明，刊登在期刊《生物化學與生物物理研究通訊》上，當初叫“微電泳技術(microelectrophoresis)”。實驗中，把鼠淋巴細胞L5178Y-S和中國倉鼠的成纖維細胞C1-1懸浮，進行物理輻照后，包埋在瓊脂糖膠中，在中性緩沖液中裂解細胞，接著在5 V·cm-1電場中電泳5 min，再用吖啶橙染色，最后用熒光顯微鏡鏡檢。發(fā)現(xiàn)DNA向陽極遷移，輻照后的細胞更明顯，還發(fā)現(xiàn)受輻照細胞能在1 h內修復超過50%的損傷[1]。

1988年彗星實驗迎來第一次重大改進。Singh進一步發(fā)明了低水平損傷DNA的定量檢測技術，把人白細胞暴露于X射線和H2O2后，瓊脂糖膠包埋，接著裂解和電泳都改為堿性條件下進行，因為中性細胞裂解液和中性電泳液不能檢測單鏈斷裂類型的DNA損傷。改進后發(fā)現(xiàn)，H2O2處理的DNA遷移模式比X射線的要整齊和同質(homogeneous)。不同類型的細胞對DNA損傷的修復能力有很大差異。Singh改進后的彗星實驗技術適用檢測單個細胞DNA損傷和修復，所需細胞少，1 000個就足夠，細胞不需要放射性標記，因此，此法適用于任何有核細胞。還能檢測同一種群的細胞對DNA損傷物的不同反應[2]，此后，1990改名為彗星實驗[3]。

1993年彗星實驗又一次改進。1993年以前，彗星實驗只能檢測DNA是否有斷裂損傷，不能分辨非斷裂損傷，不能確定DNA損傷類型。改進后的彗星實驗，可以確定氧化型非斷裂損傷。即解旋后用核酸內切酶Ⅲ(thymine glycol DNA glycosylase-Endo III, endonuclease III)處理DNA，可識別氧化損傷的嘧啶[4-6]。同樣，用甲酰氨嘧啶DNA糖基化酶fpg (formamidopyrimidine DNA glycosylase, fpg)處理后，可識別氧化損傷的嘌呤[7]，如8-氧鳥嘌呤，這些酶可造成氧化損傷部位的DNA斷裂，增加慧尾的含量。因此，可用酶切慧星實驗檢測非斷裂型DNA氧化損傷，如用Ro19-8022和可見光(主要產生8-氧鳥嘌呤)暴露肺癌細胞系A549，在細胞裂解后，用fpg處理類核體30 min或45 min，可顯著增加慧尾的濃度[8-9]。fpg修飾的彗星實驗檢測大鼠的不同組織細胞暴露于甲基磺酸甲酯(methyl methanesulfonate, MMS)后，產生高水平的氧化的或烷基化的堿基或fpg傷口[10]?？寡趸瘎ρ趸瘬p傷DNA的影響實驗表明，非吸煙健康人連續(xù)12周暴露在不同的類胡蘿卜素單體下，其淋巴細胞的內源性氧化損傷并沒有受到顯著影響，未見高水平的DNA斷裂損傷[11]，混合維生素C、維生素E和?胡蘿卜素干預非吸煙人和吸煙人，可顯著降低二者淋巴細胞的內源性DNA氧化損傷[12]，而吸煙人的高水平的氧化堿基在20 d后消失了，發(fā)現(xiàn)抗氧化劑的種類和劑型對氧化損傷的DNA修復有潛在的影響，如維生素C的緩釋劑型和快釋劑型對DNA損傷修復的效果不同，男性吸煙者只攝入緩釋型維生素C可以顯著減少fpg或核酸內切酶Ⅲ識別的損傷位點[13]。改進后的酶切彗星實驗還能提供基因的遺傳多態(tài)性相關的遺傳背景與環(huán)境因子信息，如著色性干皮病(xeroderma pigmentosum group D, XPD)基因的編碼區(qū)312-751，純合野生型基因型的彗尾密度比癌癥病人低2倍，暗示維持正常的DNA修復活性能抑制癌癥的發(fā)生和發(fā)展[14]。

彗星實驗常和微核實驗同時進行，從不同角度探索毒物的損傷效應。彗星實驗主要測定原始的DNA斷裂損傷，而微核實驗測定的是DNA不可修復的損傷，這些損傷是非修復的或不正確修復的損傷。2種實驗的結果常呈正相關。例如，非洲爪蟾幼蛙暴露在甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate, EMS)后造成其紅細胞DNA損傷和微核率增加[15]。彗星實驗還和其他指標如活性氧(ROS)結合，探索毒性機制，如乙草胺通過誘導ROS造成花背蟾蜍(Strauchbuforaddei)的DNA損傷，同時發(fā)現(xiàn)N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-l-cysteine, NAC)和褪黑素(melatonin, MEL)可減輕乙草胺造成的DNA損傷[16]。

自從Singh提出堿性彗星實驗后，在遺傳毒性檢測中得到快速發(fā)展。1999年，歐洲國家成立了一個彗星實驗專家組，一致推薦Singh的堿性彗星實驗作為檢測化學品遺傳毒性的標準方法，該法經優(yōu)化后，可用于檢測單鏈斷裂的DNA損傷、堿性不穩(wěn)定位點、DNA-DNA或DNA-蛋白質交聯(lián)損傷和單鏈斷裂的不完全切除修復位點。其特點是：可檢測低水平的DNA損傷，只需少量細胞，靈活經濟，簡便快速，例如檢測DNA損傷的修復能力。DNA損傷的修復類型有(1)切除修復。包括切除堿基缺失位點、8氧鳥嘌呤、單鏈斷裂缺口、大體積的加合物和環(huán)丁烷嘧啶二聚體等，切除修復路徑主要受翻譯后修飾調控[17]。(2)重組修復。修復的是雙鏈斷裂的缺口和鏈間交聯(lián)。(3)錯配修復。修復的是堿基的錯配、插入或缺失[18-19]。細胞應對DNA損傷，通過激活復雜的信號通路來決定細胞的命運，或者促進細胞死亡，或修復損傷而存活[20]。盡管細胞存在這些修復機制，但是DNA的損傷依然保持在較高的水平，至少在健康的人體中是這種情況。DNA的修復能力可看作是突變或癌癥的有價值的標志物，因為差的修復能力與高風險的癌癥相關，例如，頭頸鱗狀癌細胞的DNA修復能力就很差[21]。DNA的修復潛能經常用DNA芯片或RT-PCR方法，測定修復通路基因的轉錄水平，但是它的酶活性不僅依賴轉錄或翻譯水平，還要依賴表型分析的結果[22]。檢測修復過程動態(tài)的最簡單的方法是進行彗星實驗，暴露于DNA損傷物后，在不同的時間點取樣測定，進行挑戰(zhàn)實驗(challenge assay)。例如，用水溶性的?胡蘿卜素或番茄紅素培養(yǎng)的淋巴細胞，暴露在博來霉素(bleomycin)或H2O2下，結果表明?胡蘿卜素能保護DNA鏈，防止其斷裂，但是不能阻止其堿基的氧化損傷[23]。而?隱黃素(β-cryptoxanthin)能保護HeLa細胞和Caco-2細胞免受H2O2誘導的DNA損傷，呈現(xiàn)明顯的DNA修復效應。因此，標準的彗星實驗可用來測定細胞對DNA損傷的修復能力。

2000年，歐洲食品安全局主張采用系列實驗來評估化學品的遺傳毒性，即首先對化學品進行細菌回復突變實驗(后采用OECD TG471準則[24])和體外微核實驗(后采用OECD 487[25])，只要有一個實驗結果呈陽性，再進行3個體內實驗，包括哺乳動物紅細胞微核實驗(即OECD TG474準則[26])、彗星實驗(即OECD TG489準則[27])和轉基因嚙齒動物細胞基因突變實驗(即OECD TG488準則[28])。

2014年，經濟合作與發(fā)展組織(OECD)專門發(fā)布哺乳動物體內彗星實驗準則即OECD TG489[27]，內容包括實驗原理、局限性、對照信息、方法的詳細描述和彗星圖象定量打分(推薦采用的自動和半自動軟件)。其中重要的是對細胞彗星圖象進行定義，分成3類，可打分的(scorable)，非打分的(non-scorable)和刺猬形(hedgehog)?？纱蚍值腻缧羌毎x為慧核和慧尾清晰且不與其他細胞重疊的細胞。彗星評價采用慧尾DNA的百分數(shù)或慧尾強度(tail intensity, TI)，表示DNA的斷裂量，再結合校正曲線和已知條件即每個Gy可誘導每109Dalton DNA中0.3個斷裂，可計算實際DNA的斷裂頻率，校正曲線是gamma射線或X-ray的劑量(0～10 Gy)為自變量與慧尾DNA的百分數(shù)為因變量之間建立的線性關系[29-30]。刺猬形細胞DNA也叫鬼魂細胞(ghost cell)或云狀細胞，認為它是一種嚴重損傷的細胞(慧核小或不存在，大的彌散狀尾巴)。通過圖像分析得到的TI不可靠，對刺猬細胞應該單獨評價，它的形成機制還不清楚。大鼠肝細胞彗星實驗表明，它可能是破碎細胞時的機械損傷或試劑誘導的細胞毒性[31]。刺猬形彗星也不能認為是凋亡細胞或細胞毒性。這樣的慧星常表示連續(xù)的DNA損傷，應該對其進行全面評估[32]。

2 技術要點(Methodical critical steps)

彗星實驗經過不斷改進，其共同基本步驟包括制備懸浮細胞、凝膠包埋、細胞裂解、解旋、電泳、中和、染色和圖象分析。體外彗星實驗，先獲得懸浮細胞后暴露處理。體內彗星實驗，制備懸浮細胞前實驗個體進行暴露處理。其中實驗成敗的關鍵步驟應包括：

2.1 制備懸浮細胞

獲得懸浮細胞因物種而異。人、鼠、魚等常從其循環(huán)系統(tǒng)中獲取細胞，如血細胞或淋巴細胞。

蚯蚓的小細胞常用于彗星實驗，小細胞來自蚯蚓的體腔液，是體腔液中含量最豐富的細胞，類似于脊椎動物的白細胞。蚯蚓體腔細胞的收集方法，包括提取液法、穿刺法、電擊法和超聲波法等[27,33]。其中提取液法最常用，其包含：5 mmol·L-1Na2-EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)、50.4 mmol·L-1或10 mg·mL-1愈創(chuàng)木酚甘油醚、95%生理鹽水(即0.85 g NaCl溶于每100 mL H2O)或磷酸鹽緩沖液(PBS)和5%乙醇或甲醇，pH 7.3～7.5。其中EDTA或EGTA和生理鹽水或PBS的作用是維持活細胞正?；钚?。愈創(chuàng)木酚甘油醚的作用在于溶解細胞粘液，釋放細胞。乙醇或甲醇的作用刺激蚯蚓釋放體腔液。

植物彗星實驗最大困難是獲得懸浮細胞或類核，常用根和葉進行[34-35]，實驗方案因組織或物種而異[36]，通常的堿性溶液提取方法不能從植物細胞中釋放完整的DNA，用機械破碎或化學處理的方法可對DNA造成新的損傷，葉片中的高濃度色素如葉綠素和代謝物對分離DNA可能造成新的損傷，所以，棄用葉片細胞而選用根尖細胞，但是高頻率分裂的細胞對實驗又產生影響。盡管植物細胞彗星實驗比較困難，但是也有成功的例子，例如Cr(VI)對豌豆(Pisumsativum)DNA損傷實驗[37]，Cd-Zn對煙草的影響[38]。

目前認為懸浮細胞中的活細胞應不少于70%～75%，才能得到可靠的結果[39]，通常用苔盼藍染色法檢測活細胞百分數(shù)。

2.2 凝膠包埋

常用低熔點瓊脂糖凝膠包埋細胞，在三層膠法中，還用正常熔點凝膠固定低熔點膠，防止在后繼的浸泡步驟中膠從載膠板上脫落。所以，低熔點膠的濃度至關重要。不同人外周淋巴細胞和淋巴母細胞系TK-6的結果表明，膠濃度在0.6%～0.8%比較合適，太低，膠不穩(wěn)定，太高，損害慧尾。膠濃度與慧尾長度呈明顯的線性關系。損傷細胞對膠濃度更敏感。膠不能反復熔化，應該分裝保存[40]。OECD建議低熔點瓊脂糖凝膠為0.5%～1%，不建議低于0.45%(OECD 489)[27]。

2.3 細胞裂解

對包埋在低熔點膠中的完整細胞進行裂解，常用細胞裂解液的通用配方是：10 mmol·L-1Tris-HCl，100 mmol·L-1Na2EDTA，2.5 mol·L-1NaCl，10% 二甲基亞砜(DMSO)，1% Triton X-100，pH 10，裂解條件是4 ℃、至少60 min。其中Tris-HCl是緩沖體系，維持穩(wěn)定的pH值。Na2EDTA是變性劑和穩(wěn)定劑。DMSO是DNA保護劑，防止自由基對DNA的損傷。Triton X-100是表面活性劑，破壞細胞，類似的有SDS(十二烷基硫酸鈉，一種強變性劑和蛋白溶解劑)和肌氨酸鈉(sodium carcosinate)，也有在裂解液中加入蛋白酶K和氯化鈣，如提高對口哨蛙(Eleutherodactylusjohnstonei)細胞的裂解能力[41-42]。

表1 OECD 489推薦的彗星實驗陽性對照及其靶組織Table 1 Positive control substances and its target tissues in comet assay recommended by OECD 489

注： OECD 489為經濟合作與發(fā)展組織在2014年9月26日發(fā)布的化學品試驗導則：哺乳動物體內堿性彗星試驗。

Note: OECD 489 has been published by OECD on 26th September 2014. It is a guideline for the testing of chemicals:invivomammalian alkaline comet assay.

2.4 堿性解旋

解旋液和電泳液是同一種溶液，OECD 489建議配方和條件是：1 mmol·L-1Na2EDTA，300 mmol·L-1NaOH，pH≥13，4 ℃至少解旋20 min，電泳條件是4 ℃，0.7 V·cm-1，20～40 min。DNA遷移與電泳時間呈線性相關。對人外周淋巴細胞和淋巴母細胞系TK-6，以電壓1.15 V·cm-1，電泳20 min為佳，低于0.49 V·cm-1，慧尾不能展開，大于1.48 V·cm-1，慧尾從慧核上斷離，人為增加損傷程度[40]，需要記住的常識是，同樣的電泳遷移距離時，單位電壓與時間的乘積是個常數(shù)。

2.5 細胞密度

彗星的數(shù)量或密度影響圖像分析與評價，因此細胞或彗星不能重疊，以免影響彗星計分。為便于統(tǒng)計分析，需要對至少50個細胞進行圖象分析。而有效實驗能給出定性判斷的最少細胞數(shù)為30個。

2.6 陽性對照

彗星實驗必須設置陰性對照和陽性對照，保證實驗設計的合理性，實驗結果的可靠性和有效性。OECD 489推薦的哺乳動物常用陽性對照，包括甲基磺酸乙酯(EMS)等，見表1。

這些陽性對照，可能也適用于非哺乳動物，如海鱒(Salmotrutta)和北極嘉魚(Salvelinusalpinus)的精細胞暴露在甲基磺酸甲酯(MMS)中，可造成DNA損傷，并且后代的骨胳發(fā)育異常，表明這種損傷具有遺傳性[43]。三刺魚(Gasterosteusaculeatus)精子在體外受精前，體外暴露在MMS中，可造成后代的胚胎發(fā)育異常[44]。另外，4-硝基喹啉N-氧化物(4-Nitroquinoline N-oxide)是模式遺傳效應毒物，會造成斑馬魚DNA損傷和產卵量下降[45-46]。

成功的彗星實驗要考慮3個方面因素，一是細胞的類型如淋巴細胞、生殖細胞或細菌細胞、二是誘導物類型如X射線、伽馬射線、乙醇、乙醛、疾病、生活類型因素。三是方法學因素如電泳槽、載膠板、分析參數(shù)等。

3 典型應用(Main application field)

用“comet assay”作關鍵詞在2016年的PubMed和Web of Science中搜索，可得近萬篇期刊文章。涉及的主要應用領域包括：毒理學30%，遺傳學15%，環(huán)境生態(tài)科學11%和應用微生物技術9%。彗星實驗還有專門的交流網(wǎng)站http://www.cometassay.com/。

3.1 兩棲動物彗星實驗

綠蛙(Lithobatesclamitans)和非洲爪蟾(Xenopuslaevis)等的成體或幼體的紅細胞常用于體內彗星實驗，見表2。

測定的毒物效應包括，除草劑[42]、殺蟲劑[47]、MMS[15]、EMS[15]、苯并芘[15]、硫化染料[48]、金屬[49]、石油化工產物[50]、持久性有機污染物(persistent organic pollutants, POPs)[51]、抗生素[41]、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)[41]、污染的湖水[52]、煤礦[53]、垃圾場[54]、污泥[55]、污水[56-57]、城市固體廢物的焚燒物[58]和電磁場的影響[59]等。

兩棲動物彗星實驗方案，差別較大。1997年之后的實驗，細胞裂解液中才開始含有洗滌劑(表面活性劑)如Triton X-100、DMSO、SDS、肌氨酸鈉、蛋白酶K和氯化鈣等，來提高對細胞的裂解能力。細胞裂解時間25 min至7 d。細胞裂解溫度是4 ℃，而2005年之前是室溫。低熔點瓊脂糖濃度通常為0.5%，范圍通常是0.4%～1.0%，濃度越高，慧尾越少[60]。解旋變性通常是pH>13條件下5～40 min，時間越長，慧尾越多[60]。電泳電壓是18～27 V，電流是300 mA，也有用V·cm-1表示的。這些實驗方案的差異，限制了實驗結果的可比性。

3.2 魚類彗星實驗

最早的魚類彗星實驗是用加拿大五大湖的棕鲴魚(brown bullhead，Ameiurusnebulosus)和普通鯉魚(common carp，Cyprinuscarpio)對湖中沉積物的暴露實驗，提取它們的紅細胞進行singh于1988年提出的堿性彗星實驗[61]。魚的血細胞是最常用的彗星實驗材料，因為易得，易分離，而且所有魚的血液細胞都是有核細胞。而其他組織細胞如肝、腎、腮[62-64]、精細胞[65]也經常用于彗星實驗[65]。魚的酶切彗星實驗首次運用是在2003年[66]，涉及的細胞有：血細胞、肝細胞、腮細胞[67]和細胞系[68]等。

截止2017年，已經有90多種魚用于彗星實驗，實驗類型有體內實驗(invivo)[69]、體外實驗(invitro)[68]、離體實驗(exvivo)[44]和原位實驗(insite)[70]。涉及的毒物包括POPs[71]、金屬[64]、農藥[72]、藥物[73]、內分泌干擾物如四溴雙酚-A[74]、納米顆粒[75]、生物毒素[76]、核輻射[77]和紫外線[78]等。

魚類像兩棲類一樣，也沒有標準的彗星實驗方案，見表3。但是，魚的室內實驗和野生魚的生物監(jiān)測實驗中，要求使用標準的采樣方案[79]。

表3 常見魚類彗星實驗條件Table 3 Summary of comet assay parameters on fish

注：nm表示原文未提到。

Note: nm stands for not mentioned.

注：CeO2-NP表示CeO2納米顆粒。

Note: CeO2-NP stands for CeO2Nano particles; DNAse stands for deoxyribonuclease; BCPAP stands for a papillary thyroid cancer-derived cell line.

3.3 蚯蚓彗星實驗

蚯蚓的小細胞常用于彗星實驗，小細胞來自蚯蚓的體腔液，是體腔液中含量最豐富的細胞，類似于脊椎動物的白細胞。蚯蚓體腔細胞的收集方法，包括提取液法、穿刺法、電擊法和超聲波法等[33]。

有多種蚯蚓用于彗星實驗，如Eiseniafetida[80]、Amynthasdiffringens[81]、Aporrectodeacaliginosa[82]、Dendrodrilusrubidus[81]、Lumbricusterrestris[83]和Microchaetusbenhami[81]等，其中E.fetida是最常用的品種，為OECD和美國環(huán)境保護局(EPA)推薦，E.fetida和A.caliginosa對污染物有相同的敏感性[82]，而D.rubidus對重金屬Cd最敏感，其次是E.fetida[81]，例見表4。

3.4 哺乳動物精細胞彗星實驗

哺乳動物的彗星實驗，人和鼠最常見，涉及的細胞主要是血細胞和淋巴細胞，其他還有心、肝、肺、腎、腦、骨髓等細胞，例見表5和表6。

常用改進的彗星實驗檢測精子的DNA損傷與不孕的關系[84]，叫做二維垂直慧尾彗星實驗TT-comet (two-dimensional perpendicular tail comet assay, TT-comet)，適合區(qū)分單鏈斷裂和雙鏈斷裂的精細胞[85]。精細胞和體細胞對相同毒物的反應差別很大，因為體細胞的異染色質是組蛋白而精細胞的則是精蛋白[86]。因此，去除對照的DNA結合蛋白的裂解條件具有物種的特異性，不同物種的精細胞DNA的結構不同，因而，不同物種的TT-comet條件各不相同，需要摸索。一般，去除蛋白的精細胞DNA先進行中性電泳，產生雙鏈斷裂的慧尾，然后轉膠90度，進行堿性電泳，產生單鏈斷裂的或堿不穩(wěn)定的慧尾。

4 存在的問題與注意點(Questions and defects)

(1)大部分已經發(fā)表的文獻，彗星實驗設計缺少陽性對照，降低了實驗的正確性和合理性。可參考OECD 489推薦的彗星實驗陽性對照(見表1)。另外，文獻中提供的彗星實驗圖片較少，只有統(tǒng)計圖表，這樣說服力不強，降低了文章的可靠性，在引用時需要注意。還需要了解的是，2016年以前的彗星實驗，以低通量為主，一次實驗的處理數(shù)和重復數(shù)設置都不是太多。

(2)彗星實驗方案不統(tǒng)一，每種生物基本沒有標準的實驗方案，限制了結果的可比性。不同物種，不同細胞類型使用同一種實驗，可能導致實驗失敗，例如，在蚯蚓體腔細胞的彗星實驗中，細胞裂解液中的Triton-100濃度采用通常值1%，就不合適(未發(fā)表)，很難得到完美的實驗圖象。

(3)DNA鏈的斷裂損傷類型因組織和細胞類型而異[87]。因此，不能用血細胞DNA損傷類型和程度來推斷其他細胞DNA的損傷。如，用彗星實驗比較細鱗鯻(Theraponjarbua)的腮細胞、腎細胞和血細胞對氯化汞損傷的敏感性，結果表明腮細胞最敏感、腎細胞次之、血細胞最不敏感[88]。同樣，不能用不同類型的細胞進行修復能力的相互推斷[60]，如劍尾魚(Xiphophorusspecies)腦部細胞對核苷酸切除修復能力大于腮部和肝部細胞[89]。

(4)注意細胞周期對彗星實驗結果的影響。細胞處于不同周期如S期或M期，進行彗星實驗，都能進行損傷測定[90-91]，在堿性條件下S期的DNA遷移速度比中性條件下快，因為在堿性條件下S期的DNA呈復制叉狀，類似單鏈斷裂DNA，而在中性條件下呈復制泡狀[92]。

(5)運用彗星實驗結果評價毒物的DNA毒性時，還必須考慮非毒物相關因子，包括生物的和非生物因子對彗星實驗的影響。例如，水中缺氧或氧過飽和時，都能增加鯉魚(Cyprinuscarpio)的DNA損傷，幅度約為正常氧濃度的20%[93]。激流中生活的白鮭(Leuciscuscephalus)DNA損傷會增加，暗示生活在污染激流中的魚面臨更為嚴重的DNA損傷風險[67]。實驗生物的年齡、性別等對彗星實驗結果也有影響，如成年法國比目魚(Limandalimanda)面對同樣的毒物，雄性DNA損傷比雌性高，幼魚則相反，成年魚比幼魚高[94]。此外，需要評估組織取樣時使用的麻醉劑對DNA可能造成損傷。但是，苯唑卡因(benzocaine)對羅非魚(Niletilapia)的彗星實驗結果無影響[95]。