肖正俊，阿良*，李洪秋，鄧純博，沈曉桐

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院骨外科，遼寧 沈陽(yáng) 110024；2.婦產(chǎn)科）

外傷、感染、腫瘤等疾病所導(dǎo)致的骨缺損填充和重建對(duì)骨移植材料有非常大的需求，顯示了骨移植龐大的應(yīng)用市場(chǎng)?，F(xiàn)有骨缺損的治療方法主要有三種：（1）自體骨移植、同種異體骨移植和異種骨移植；（2）骨延長(zhǎng)術(shù)；（3）誘導(dǎo)膜技術(shù)。三者不是取自體骨或異體骨，就是二次手術(shù)且手術(shù)周期長(zhǎng)，給患者身心帶來(lái)巨大傷害［1］。近年來(lái)，組織工程骨膜技術(shù)研究發(fā)展迅速，具有廣闊的應(yīng)用前景，現(xiàn)予以綜述。

1 組織工程骨膜技術(shù)

1.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrowmesenchymal stem cells，BMSCs） BMSCs起源于中胚層，存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，其中以骨髓中含量最為豐富，是骨髓中非造血干細(xì)胞，能夠支持體外造血和促進(jìn)體內(nèi)造血功能重建，具有自我復(fù)制和多向分化潛能［2］，在一定的誘導(dǎo)條件下能夠分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等成熟細(xì)胞，易于提取和培養(yǎng)，且免疫原性低［3-4］。

1.2 人脫細(xì)胞羊膜（human acellular amniotic membrane，HAAM） 有研究證實(shí)，羊膜本身就是一種良好的生物材料［5］。HAAM以健康足月孕婦羊膜為基礎(chǔ)原料，75%乙醇進(jìn)行病毒滅活，使用0.25%胰蛋白酶脫細(xì)胞處理，配置碳二亞胺：N-羥基琥珀酰亞胺（4：1）體系進(jìn)行交聯(lián)改性，之后無(wú)菌條件下采用生理鹽水清洗，完全洗去殘留試劑，僅保留了基膜層和致密層，有效地去除了羊膜中的細(xì)胞成分，保留了纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步降低了抗原性［6］。羊膜脫細(xì)胞材料屬于可吸收膠原類(lèi)材料，能夠作為種子細(xì)胞和材料支架應(yīng)用于組織工程骨膜中，為骨缺損的修復(fù)帶來(lái)了希望［7］。

1.3 組織工程骨膜（tissue engineering periosteum）

組織工程骨膜基于生命科學(xué)與工程學(xué)的原理，選取BMSCs作為定向分化成骨細(xì)胞的種子，HAAM作為BMSCs附著、增殖和分化的可降解的支架材料，復(fù)合細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子而成。組織工程骨膜結(jié)合了兩者的優(yōu)點(diǎn)，不改變細(xì)胞相容性和HAAM原本的特性，并能夠在一定程度上保護(hù)細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而產(chǎn)生骨膜的結(jié)構(gòu)和功能，其置于骨缺損區(qū)域可誘導(dǎo)成骨的生長(zhǎng)［6］。組織工程骨膜既有良好的生物相容性、組織學(xué)和理化特性，又有生物降解性、透明性等優(yōu)點(diǎn)，作為組織工程骨膜支架材料有其獨(dú)特的優(yōu)越性［8］。

2 組織工程骨膜分類(lèi)

2.1 宏觀組織工程骨膜（bionic macrostructure tissue-engineering periosteum） 在生物膜上培養(yǎng)細(xì)胞是制造組織工程骨膜最簡(jiǎn)單的方法，可以容易地模仿骨膜的粗糙結(jié)構(gòu)。在體外，BMSCs負(fù)載于生物膜上黏附和增殖良好，已經(jīng)合成了骨膜樣材料。而且受骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）刺激的影響，骨膜樣材料中的成骨細(xì)胞顯示潛在的生長(zhǎng)差異。在體內(nèi)，通過(guò)BMSCs接種在人脫細(xì)胞真皮上用于骨缺損治療，6～8周骨缺損成功愈合，表明通過(guò)在膜的表面上培養(yǎng)細(xì)胞，例如人脫細(xì)胞真皮攜帶BMSCs和骨誘導(dǎo)蛋白可以制造組織工程骨膜［9］。

同種異體骨移植中不存在骨膜及其干細(xì)胞群體，影響骨缺損愈合。Hoffman等［10-11］使用可降解的水凝膠作為BMSCs支架，并將其與干細(xì)胞移植到同種異體移植物表面上，可導(dǎo)致移植物血管化增強(qiáng)及軟骨內(nèi)骨形成增多，再添加額外骨祖細(xì)胞用于共系培養(yǎng)，可預(yù)防骨化延遲，達(dá)到組織工程化“擬生態(tài)骨膜”，增強(qiáng)骨缺損治療效果。

靜電紡絲技術(shù)（簡(jiǎn)稱(chēng)“電紡”）是一種在高壓電場(chǎng)作用下形成超細(xì)纖維的聚合物加工技術(shù)，通過(guò)控制電紡過(guò)程的各種參數(shù)可以制成性能不同的納米纖維支架。電紡納米纖維也是組織工程骨膜制造的有吸引力的基礎(chǔ)。含地塞米松（DEX）的聚乙烯醇（PVA）納米纖維合成具有控制釋放特性的人工骨膜，培養(yǎng)3周后，通過(guò)DEX誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，具有高表達(dá)的骨基因和蛋白質(zhì)［12］。因此，電紡納米纖維被認(rèn)為是滿足基本要求的人造骨膜。

由法國(guó)醫(yī)師 Masquelet等［13］提出的誘導(dǎo)膜（IM）技術(shù)也已經(jīng)用于組織工程骨膜，對(duì)35例長(zhǎng)骨缺損患者清創(chuàng)后，將骨缺損部位填入骨水泥（聚甲基丙烯酸甲酯，PMMA），在其周?chē)T導(dǎo)生物膜形成，6～8周后去除骨水泥，將顆粒狀自體松質(zhì)骨填充骨缺損部位并固定，取得良好治療效果。Cuthbert等［14］用IM技術(shù)治療臨界尺寸骨缺損患者，并與健康股骨干骨膜比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IM誘導(dǎo)的骨膜厚度顯著增加，淋巴細(xì)胞、周細(xì)胞的數(shù)目顯著提高，可表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF-1）等關(guān)鍵組織再生因子，并且IM誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)的SDF-1轉(zhuǎn)錄物表達(dá)量是健康骨膜細(xì)胞的2倍。IM被認(rèn)為是體內(nèi)合成的組織工程骨膜，是組織工程骨膜的一個(gè)典型例子。

2.2 微觀組織工程骨膜（bionic microstructure tissue-engineering periosteum） 雖然相關(guān)研究顯示宏觀組織工程骨膜增強(qiáng)了骨再生，但是與天然骨膜的表面形態(tài)和微結(jié)構(gòu)存在明顯的差異，這可能降低治療效果。為了無(wú)限接近天然骨膜的微結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)證明直接使用無(wú)細(xì)胞骨膜，使大鼠的顱蓋缺損恢復(fù)良好，顯示骨膜微結(jié)構(gòu)的重要性［15］。為了更好地顯示微觀組織工程骨膜的意義，Shi等［15］在聚乳酸-共-乙醇酸（PLGA）納米片上產(chǎn)生了微槽結(jié)構(gòu)，可指導(dǎo)細(xì)胞優(yōu)選沿著微槽結(jié)構(gòu)方向傳播，以調(diào)節(jié)干細(xì)胞的空間取向并應(yīng)用不同的機(jī)械拉伸作用促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)，在骨生長(zhǎng)和重建中起著重要作用?？梢?jiàn)，我們應(yīng)該更加重視微觀組織工程骨膜，進(jìn)一步的探索。

2.3 血管化組織工程骨膜（vascularized tissueengineered periosteum） 在天然骨膜中血管組織豐富，血管生成在骨發(fā)育和骨折修復(fù)中有重要作用，可以為骨膜提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)成分。誘導(dǎo)組織工程骨膜中血管化是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。van Gastel等［16］研究了小鼠骨膜來(lái)源細(xì)胞（periosteum derived cells，PDCs）的致血管生成特性，發(fā)現(xiàn)PDCs能表達(dá)并分泌VEGF，從而增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和存活；與內(nèi)皮細(xì)胞共移植發(fā)現(xiàn)，PDCs可通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞形成周細(xì)胞樣表型來(lái)增強(qiáng)血管發(fā)生。VEGF和VEGFR主要參與血管生成，Hah等［17］對(duì)人PDCs細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化過(guò)程進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)VEGF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGFR-1、VEGF-2的表達(dá)，而外源性人VEGF可刺激PDCs的成骨細(xì)胞分化過(guò)程，并且VEGF可充當(dāng)人PDCs的成骨細(xì)胞分化的自分泌生長(zhǎng)因子。這些結(jié)果研究表明，骨膜細(xì)胞不僅通過(guò)其成骨潛能，而且還通過(guò)其促血管生成的特點(diǎn)，有助于骨折修復(fù)，從而為骨再生治療提供理想的細(xì)胞來(lái)源。

3 組織工程骨膜治療骨缺損

目前，雖然沒(méi)有應(yīng)用于臨床上的大段骨缺損的治療，但是治療小面積骨缺損時(shí)有報(bào)道。Nagata等［18］將培養(yǎng)的自體骨膜細(xì)胞（CAPCs）、自體骨顆粒和富含血小板的血漿混合，并移植修復(fù)唇腭裂患者的牙槽骨，術(shù)后顯示骨再生良好，骨活檢顯示再生骨周?chē)奂晒羌?xì)胞和破骨細(xì)胞并伴隨血管生成，并且CAPCs骨移植的自體骨顆粒的重建速度明顯快于常規(guī)植骨。Pradel等［19］比較組織工程骨和自體松質(zhì)骨治療腭裂患者的療效差別，術(shù)后6個(gè)月隨訪發(fā)現(xiàn)，組織工程骨移植組的裂口平均體積低于自體松質(zhì)骨移植組，而組織工程移植組的腭裂缺陷骨化率（40.9%）明顯高于自體松質(zhì)骨移植組（36.6%）。

一直以來(lái)大家都認(rèn)為關(guān)節(jié)軟骨損傷（或缺損）為不可逆修復(fù)，伴隨著組織工程骨膜修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷（或缺損）技術(shù)［20］的問(wèn)世，徹底打破這一定論。Oehi等［21］將體外分離的自體軟骨細(xì)胞接種到膠原蛋白凝膠中，培養(yǎng)21～26 d后移植到軟骨缺損處，治療后可減低患者的疼痛和腫脹，1年后隨訪發(fā)現(xiàn)，患者疼痛消失，移植處形成透明堅(jiān)固表面光滑的關(guān)節(jié)軟骨，且再生軟骨的硬度與周?chē)＼浌且恢?，結(jié)果表明通過(guò)組織工程制造的軟骨樣組織的移植有望成為長(zhǎng)時(shí)間獲得軟骨的最有效的技術(shù)，其在缺陷處產(chǎn)生的軟骨與正常軟骨有相似的生物化學(xué)和生物力學(xué)特性。另一種軟骨缺陷修復(fù)方法是基質(zhì)誘導(dǎo)的自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)，即體外培養(yǎng)的自體軟骨細(xì)胞接種到Ⅰ/Ⅲ型膠原膜上，將纖維蛋白注射到缺陷處軟骨表面用以固定膠原膜，膠原膜修剪后移植到軟骨缺損處，使關(guān)節(jié)軟骨再生，臨床療效已經(jīng)得到了證實(shí)［22］。

綜上所述，組織工程骨膜技術(shù)應(yīng)用于骨缺損治療，特別是關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療，具有較好的臨床效果。但是，組織工程骨膜技術(shù)治療骨缺損仍存在一定的爭(zhēng)議。一些學(xué)者持懷疑態(tài)度，他們認(rèn)為HAAM雖是可降解和吸收材料，但是采取異體間植入骨缺損處是否會(huì)產(chǎn)生倫理問(wèn)題有待商榷。支持者則認(rèn)為這是醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)步，為患者康復(fù)帶來(lái)希望。目前，組織工程骨膜在相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到十足發(fā)展，為其將來(lái)的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。然而，人工骨膜如何能無(wú)限接近天然骨膜，從而滿足骨缺損的臨床需求，如何解決移植物的免疫調(diào)節(jié)等問(wèn)題仍有待深入研究。

［1］ Blick SS，Brumback RJ，Lakatos R， et al.Early prophylactic bone grafting of high-energy tibial fractures［J］.Clin Orthop RelatRes，1989（240）：21-41.

［2］虞冀哲，董學(xué)海，陳海丹，等.間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于軟骨組織工程的研究進(jìn)展［J］.生物骨科材料與臨床研究，2015，12（4）：60-64.

［3］Yin F，Guo L，Meng CY，etal.Transplantation ofmesenchymal stem cells exerts anti-apoptotic effects in adult rats after spinal cord ischermia-reperfusion injury［J］.Brain Res，2014，1561：1-10.

［4］ Neirinckx V，Agirman G，Coste C，et al.Adult bone marrow mesenchymal and neural crest stem cells are chemoattractive and accelerate motor recovery in amousemodel of spinal cord injury［J］.Stem CellRes Ther，2015，6：211.

［5］楊志明.組織工程［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001：41-43.

［6］ Okabe M，Kitagawa K，Yoshida T，et al.Hyperdry human amniotic membrane is useful material for tissue engineering：physical， morphological properties， and safety as the new biological material［J］.J Biomed Mater Res A， 2014， 102（3）：862-870.

［7］ Muhonen V， Salonius E， Haaparanta AM， et al.Articular cartilage repair with recombinant human type II collagen/polylactide scaffold in a preliminary porcine study［J］.JOrthop Res，2016，34（5）：745-753.

［8］Robinson D，Bab I，Nevo Z.Osteogenic growth peptide regulates proliferation and osteogenicmaturation of human and rabbit bone marrow stromal cells［J］.JBone Miner Res， 1995，10 （5）：690-696.

［9］ Lai JY， Lue SJ， Cheng HY， et al.Effect of matrix nanostructure on the functionality of carbodiimide cross-linked amniotic membranes as limbal epithelial cell scaffolds ［J］.J Biomed Nanotechnol， 2013，9（12）：2048-2062.

［10］ Hoffman MD， Xie C， Zhang X， et al.The effect of mesenchymal stem cells delivered via hydrogelbased tissue engineered periosteum on bone allograft healing ［J］.Biomaterials，2013，34（35）：8887-8898.

［11］ Hoffman MD， Benoit DS.Emulating native periosteum cell population and subsequent paracrine factor production to promote tissue engineered periosteummediated allograft healing［J］.Biomaterials，2015，52：426-440.

［12］ Su WT，Chiou WL，Yu HH，etal.Differentiation potential of SHEDs using biomimetic periosteum containing dexamethasone［J］.Mater SciEng CMater Biol Appl，2016，58：1036-1045.

［13］ Masquelet AC， Fitoussi F，Begue T， et al.Reconstruction of the long bones by the induced membrane and spongy autograft［J］.Ann Chir Plast Esthet， 2000， 45 （3）： 346-353.

［14］ Cuthbert RJ， Churchman SM， Tan HB， et al.Induced periosteum a complex cellular scaffold for the treatment of large bone defects［J］.Bone，2013，57（2），484-492.

［15］ Shi X，F(xiàn)ujie T，Saito A，et al，Periosteum-mimetic structuresmade from freestandingmicrogrooved nanosheets［J］.Adv Mater，2014，26（20）：3290-3296.

［16］ van Gastel N，Torrekens S，Roberts SJ， et al.Engineering vascularized bone：osteogenic and proagiogenic potential of murine perioteal cells［J］.Stem Cells， 2012， 30 （11）：2460-2471.

［17］ Hah YS，Jun JS，Lee SG，et al.Vascular endothelial growth factor stimulates osteoblastic differentiation of cultured human periosteal-derived cells expressing vascular endothelial growth factor receptors［J］.Mol Biol Rep，2011，38 （2）：1443-1450.

［18］NagataM，Hoshina H，LiM，etal.A clinical study ofalveolar bone tissue engineering with cultured autogenous periosteal cells：coordinated activation of bone formation and resorption［J］.Bone，2012，50（5）：1123-1129.

［19］PradelW，Lauer G.Tissue-engineered bone grafts for osteoplasty in patients with cleft alveolus［J］.Ann Anat，2012，194（6）：545-548.

［20］Crawford DC，DeBerardinoTM，Williams RJ 3rd.NeoCart，an autologous cartilage tissue implant，compared with microfracture for treatment of distal femoral cartilage lesions：an FDA phase-II prospective，randomized clinical trial after two years［J］.JBone JointSurg Am，2012，94（11）：979-989.

［21］OchiM，Uchio Y，Tobita M， etal.Current concepts in tissue engineering technique for repair of cartilage defect［J］.Artif Organs，2001，25（3）：172-179.

［22］CraigW，Wood DJ，Zheng MH，etal.A current review on the biology and treatment of articular cartilage defect ［J］.J MusculoskeletRes，2003，7：157-181.