馮五文，王晶，張世洋，唐飛，盛永成，敖慧，彭成

注射用雙黃連（凍干）（以下稱(chēng)雙黃連凍干粉）是由金銀花、連翹、黃芩制成的臨床常用的廣譜抗病毒中藥注射劑，然而，近年來(lái)屢屢發(fā)生的不良反應(yīng)給雙黃連凍干粉的使用蒙上了陰影。作為一種使用廣泛且不良反應(yīng)高發(fā)的注射劑品種，雙黃連凍干粉亟需建立有效的質(zhì)量控制方法保障其質(zhì)量。指紋圖譜作為控制中藥注射劑質(zhì)量的重要手段，已被2015版《中國(guó)藥典》用于雙黃連凍干粉的質(zhì)量控制，然而，該版藥典僅對(duì)7個(gè)特征峰進(jìn)行了控制，難以全面反應(yīng)雙黃連凍干粉的特征成分。因此，有必要對(duì)雙黃連凍干粉建立更有效的指紋圖譜質(zhì)量控制方法。在收集與制備不同雙黃連凍干粉樣品的基礎(chǔ)上，建立雙黃連凍干粉的UPLC指紋圖譜，并結(jié)合相似度分析和聚類(lèi)分析進(jìn)行樣品的質(zhì)量分析與評(píng)價(jià)，為雙黃連凍干粉質(zhì)量控制的提高提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

儀器：超高效液相色譜儀（Waters Acquity Ultra Performance LC，美國(guó)）；Masslynx 4.1 色譜工作站；ACQUITY UPLC? HSS T3 色譜柱（2.1mm ×100 mm；1.8 μm）；Milli-Q超純水機(jī)（Millipore，美國(guó)）；KQ-5000DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；十萬(wàn)分之一電子分析天平（AB135-S，Mettler Toledo，瑞士）。

試劑：乙腈為色譜純（Fisher，美國(guó)），磷酸為分析純（北京化工廠），水為哇哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

對(duì)照品：綠原酸（MUST-12031402）、隱綠原酸（MUST-11112203）、新綠原酸（MUST-11112203）、異綠原酸A（MUST-11061601）、咖啡酸（MUST-12042405）、異綠原酸B（MUST-11083102）、異綠原酸C（MUST-11081803）、連翹酯苷A（MUST-11052001）、黃芩苷（MUST-11101403）、1,3-二咖啡?？崴幔∕UST-11060601），黃芩素（MUST-10031701）。以上對(duì)照品均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司，純度均大于98%。

樣品來(lái)源：正常雙黃連樣品（NS1-NS5）、過(guò)期雙黃連樣品（GQ1-GQ5）及臨床導(dǎo)致過(guò)不良反應(yīng)的雙黃連樣品（AR1-AR5）由哈藥集團(tuán)中藥二廠生產(chǎn)。為模擬雙黃連凍干粉運(yùn)輸儲(chǔ)藏過(guò)程可能出現(xiàn)的情況，同時(shí)制備了雙黃連凍干粉處理樣品。高溫處理樣品（TS1-TS5）的制備：取正常樣品于60℃恒溫箱中放置10天即得；光照處理樣品（LS1-LS5）的制備：取正常樣品于光照強(qiáng)度4500 ± 500Lx的可調(diào)光源下持續(xù)照射10天制得；暴露處理樣品（ES1-ES5）的制備：取正常樣品，開(kāi)啟瓶口后放置于室溫避光環(huán)境10 天制得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動(dòng)相乙腈（A），0.2%甲酸-水（B）；流速0.2 mL?min-1梯度洗脫；柱溫室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)350nm；進(jìn)樣量為5 μL。梯度洗脫程序：0～5 min，8%～10% A；5～10 min，10%～12% A；10～11 min，12%～18% A；11～18 min，18%～25% A；18～24 min，25%～30% A；24～28 min，30%～50% A；28～29 min，50%～100% A。

2.2 對(duì)照品及供試品溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱(chēng)取黃芩素、黃芩苷、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、連翹酯苷A、異綠原酸C、異綠原酸B、異綠原酸A、1,3-二咖啡?？崴釋?duì)照品適量，置棕色容量瓶中，甲醇溶解，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，置4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱(chēng)取雙黃連凍干粉粉末適量，置棕色容量瓶中，加水使溶解，制成每1 mL含30 mg固體的溶液，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾即得，置4 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別計(jì)算各共有峰的保留時(shí)間與峰面積RSD值，結(jié)果表明，各共有峰保留時(shí)間的RSD均小于5%，峰面積的RSD均小于5%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于制備后0、1、2、4、6、8 h進(jìn)樣，按2.1項(xiàng)進(jìn)行色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明，各共有峰的保留時(shí)間和峰面積RSD均小于5%，說(shuō)明供試品溶液在8小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品，平行制備供試品溶液6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定指紋圖譜，結(jié)果表明，各共有峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于5%，說(shuō)明重復(fù)性良好。

2.4 樣品測(cè)定

取25批正常注射用雙黃連（凍干）樣品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖，混合對(duì)照品溶液和典型注射用雙黃連（凍干）溶液色譜圖見(jiàn)圖1，所有批次樣品色譜圖見(jiàn)圖2。通過(guò)選擇5批正常注射用雙黃連（凍干）樣品，確定了26個(gè)共有峰在正常樣品中均有出現(xiàn)。通過(guò)對(duì)照品指認(rèn)，確定了其中11個(gè)共有峰：新綠原酸（1號(hào)峰）、綠原酸（5號(hào)峰）、隱綠原酸（6號(hào)峰）、咖啡酸（7號(hào)峰）、1,3-二咖啡酰奎尼酸及（10號(hào)峰）、連翹酯苷A（14號(hào)峰）、:異綠原酸B（17號(hào)峰）、異綠原酸A（18號(hào)峰）、異綠原酸C（19號(hào)峰）、黃芩苷（20號(hào)峰）、黃芩素（25號(hào)峰）。

圖1 注射用雙黃連（凍干）混合標(biāo)準(zhǔn)品與正常樣品色圖譜

圖2 不同批次注射用雙黃連（凍干）化學(xué)指紋圖譜

2.5 參照峰的選擇

在各批次注射用雙黃連（凍干）樣品中，20號(hào)峰（黃芩苷）保留時(shí)間適中，相對(duì)峰面積最大，且分離度好，故選擇20號(hào)峰為參照峰。在此基礎(chǔ)上，計(jì)算各批次樣品中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

2.6 數(shù)據(jù)分析

2.6.1 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 將測(cè)定獲得的30批雙黃連凍干粉指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004A 版）進(jìn)行分析，采用5批正常樣品圖譜生成標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照特征圖譜R。30批樣品與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照特征圖譜R的相似度匹配結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 雙黃連（凍干）正常樣品與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照?qǐng)D譜R相似度

2.6.2 層次聚類(lèi)分析 以共有峰的相對(duì)峰面積為聚類(lèi)變量，采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件，對(duì)雙黃連正常樣品與特殊處理樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析。聚類(lèi)方法采用組間聯(lián)接法，以Euclidean距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，以全距從0到1的標(biāo)準(zhǔn)化法進(jìn)行聚類(lèi)，聚類(lèi)結(jié)果見(jiàn)圖3。

4 討論

中藥指紋圖譜評(píng)價(jià)方法將中藥視為內(nèi)部成分相互聯(lián)系的整體，是從整體的角度出發(fā)控制中藥質(zhì)量的方法，具有能反應(yīng)中藥多組分、多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn)[1,2]。因此，指紋圖譜評(píng)價(jià)法已被WHO等機(jī)構(gòu)采納用于草藥及制品的質(zhì)量控制。《中國(guó)藥典》2010版對(duì)雙黃連凍干粉的化學(xué)成分控制包含了指紋圖譜檢查與成分含量控制，分別采用不同的色譜條件對(duì)指紋圖譜和3個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行檢測(cè)，步驟操作繁瑣；目前文獻(xiàn)報(bào)道的雙黃連凍干粉指紋圖譜研究主要是采用HPLC法，運(yùn)行時(shí)間一般在100 min左右，具有檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、特征參比峰少等特點(diǎn)[3-6]，不利于樣品的檢測(cè)。UPLC是一種近年來(lái)較為常用的色譜分離技術(shù)，相對(duì)于傳統(tǒng)的HPLC 技術(shù)，具有更號(hào)的分離度、靈敏度以及分離速度[7,8]。應(yīng)用UPLC技術(shù)，本文建立了雙黃連凍干粉的質(zhì)量控制方法，相對(duì)于目前文獻(xiàn)報(bào)道的方法，本文建立的方法具有檢測(cè)時(shí)間更短，特征峰信息更多的特點(diǎn)，能為提高雙黃連凍干粉質(zhì)控水平提供參考。

圖3 不同注射用雙黃連（凍干）聚類(lèi)分析結(jié)果

為全面地反映所建立方法的有效性，收集了不同類(lèi)型的雙黃連凍干粉，包括正常樣品、臨床上導(dǎo)致過(guò)不良反應(yīng)的樣品以及過(guò)期樣品，并結(jié)合實(shí)際儲(chǔ)藏、運(yùn)輸過(guò)程中可能遇到的情況，制備了高溫處理樣品、暴露處理樣品、光照處理樣品。指紋圖譜顯示，特殊樣品的10號(hào)峰左右的色譜峰（圖2虛線標(biāo)記）與正常樣品有較大差異，提示1,3-二咖啡?？崴岬瘸煞只瘜W(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易受光照等影響，其含量差異可用于反應(yīng)雙黃連凍干粉的質(zhì)量。相似度分析結(jié)果表明，正常樣品色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)色譜圖具有較高的相似度（≥0.999），而特殊樣品與標(biāo)準(zhǔn)色譜圖也具有較高的相似度（≥0.997），提示相似度分析不能很好地用于區(qū)分特殊樣品。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，正常樣品能聚為一類(lèi)，表明所建立的方法能較好地區(qū)分正常樣品與特殊樣品；同時(shí)，不良反應(yīng)樣品通過(guò)聚類(lèi)分析被聚到不同特殊樣品組中，提示臨床上引發(fā)不良反應(yīng)的原因與多種因素有關(guān)。綜合聚類(lèi)分析結(jié)果，所建立的方法能較好地區(qū)分正常樣品與特殊樣品，為雙黃連凍干粉質(zhì)量控制方法的提高提供了依據(jù)。