EAAs在腦缺血損傷中的毒性作用及其干預(yù)藥物

張歡歡，高原雪，何林，李敏，王斌，康亞國

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽712046)

興奮性氨基酸(EAAs)是指具有2個羧基和1個氨基的酸性游離氨基酸，包括谷氨酸(Glu)、天門冬氨酸(Asp)。正常情況下，興奮性氨基酸主要存在于神經(jīng)末梢的突觸囊泡內(nèi)，末梢去極化時釋放至突觸間隙，作用于突觸后膜的特異性受體，完成興奮性突觸傳遞及其他生理作用。腦缺血損傷的機制涉及Ca2+超載、炎癥反應(yīng)、EAAs積聚等多個環(huán)節(jié)，它們相互作用、相互影響，最終導(dǎo)致大腦皮層細胞和海馬神經(jīng)元損傷或死亡以及腦組織壞死軟化[1]。腦缺血損傷過程中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)EAAs積聚，突觸后膜的EAAs受體被過度激活，刺激腦細胞發(fā)生一系列變化，最終導(dǎo)致腦細胞死亡。本文結(jié)合文獻闡述了EAAs在腦缺血損傷中的毒性作用及其干預(yù)藥物，旨在為腦缺血損傷的治療及其藥物研發(fā)提供參考。

1 EAAs及其受體概述

1.1 EAAs及其作用 EAAs是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在生理狀態(tài)下，可參與突觸的興奮傳遞，促進學(xué)習(xí)記憶。但在病理狀態(tài)下，EAAs含量升高，可觸發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)過度興奮，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)能量代謝失衡，產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用[2，3]。EAAs主要包括Glu、Asp，其中Glu對神經(jīng)元損傷具有關(guān)鍵性作用。Glu是腦內(nèi)含量最高的氨基酸，以大腦皮層和海馬含量最高。但Glu不能通過血腦屏障，只能由葡萄糖和其他前體經(jīng)不同化學(xué)途徑在腦內(nèi)合成[4]。生理狀態(tài)下，腦細胞外的Glu不斷被神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞上的Glu轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運至腦細胞內(nèi)，故腦細胞內(nèi)儲存了較多的游離Glu，而細胞外液中Glu含量較低。當神經(jīng)元等細胞去極化時，細胞內(nèi)Glu釋放到突觸間隙，與突觸后膜不同亞型Glu受體結(jié)合，完成興奮性突觸傳遞及其他生理作用，隨后依賴神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞膜上Glu轉(zhuǎn)運體攝回而被迅速滅活，通過谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)轉(zhuǎn)化成新的Glu進行再循環(huán)，故不易引起EAAs毒性作用。而在病理狀態(tài)下，Glu大量釋放或Glu清除障礙，Glu在細胞間隙大量堆積，產(chǎn)生很強的神經(jīng)毒性作用。李寧等[5]采用腦內(nèi)微透析技術(shù)監(jiān)測腦缺血大鼠海馬細胞外液中EAAs含量變化，發(fā)現(xiàn)缺血20 min細胞外液Glu、Asp含量開始明顯升高，之后持續(xù)性升高，缺血60 min達到高峰，并發(fā)現(xiàn)腦缺血程度與EAAs釋放量呈正相關(guān)關(guān)系。李菊等[6]觀察了大鼠腦缺血30、60 min時海馬細胞外液EAAs含量，發(fā)現(xiàn)缺血60 min時海馬細胞外液EAAs含量明顯升高，而且缺血越嚴重，EAAs含量越高。有研究還發(fā)現(xiàn)，細胞外間隙中EAAs含量升高亦能產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性作用[4，7]。程方敏等[7]研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死急性期(發(fā)病12 h內(nèi))腦脊液中Glu、Asp含量即明顯升高，比CT能檢測到病灶提前了36～60 h。因此認為，EAAs可早期診斷腦梗死發(fā)生。武祺等[8]通過分析50例腦梗死患者腦脊液發(fā)現(xiàn)，腦脊液中Glu在發(fā)病24 h內(nèi)即可明顯升高，而這種升高狀態(tài)可持續(xù)1周。研究發(fā)現(xiàn)，動物在腦缺血2 h內(nèi)細胞外液即可出現(xiàn)Glu、Asp明顯升高，而腦梗死患者則多在缺血24 h內(nèi)明顯升高[1]，這可能與種屬、腦缺血程度等有關(guān)。

1.2 EAAs受體及分布 與EAAs相關(guān)的受體主要為Glu受體。Glu受體主要有離子型受體和代謝型受體兩種。離子型受體包括NMDA受體、AMPA受體、KA受體和L-AP4受體，后三種又稱為非NMDA受體。而NMDA受體又包含NR1、NR2(NR2A、NR2B、NR2C、NR2D)、NR3(NR3A、NR3B)亞型，主要分布于突觸前膜、突觸后膜和突觸后致密區(qū)以及非突觸細胞膜上。其中，NR1廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，以海馬、大腦皮層、小腦最豐富；NR2一般存在于具有NR1的特定腦區(qū)，主要作用是提升NR1對氨基酸的反應(yīng)；NR3主要存在于海馬、腦皮質(zhì)和運動神經(jīng)元中。AMPA受體由GLUR1、GLUR2、GLUR3和GLUR4四個亞單位組成，主要分布于突觸后膜、樹突的表面和細胞質(zhì)中。KA受體由Glu5、Glu6、Glu7、KA1和KA2五種亞基組成，主要分布在海馬區(qū)、腦皮質(zhì)區(qū)和小腦等部位，尤其在海馬區(qū)分布最為密集[9]。L-AP4受體可能主要位于興奮性突觸的前膜，對Glu的釋放起負反饋作用。而代謝型受體包括mGluR1、mGluR3-8，主要分布于大腦皮層和海馬等處的突觸前膜和突觸后膜上[10]。

2 EAAs毒性損傷及其機制

目前認為，EAAs受體在興奮性毒性損傷過程中發(fā)揮著重要作用。當NMDA受體激活時，其偶聯(lián)的陽離子通道開放，允許Na+、K+和Ca2+通過，從而觸發(fā)時程增強和長時程抑制，對大腦學(xué)習(xí)、記憶、認知等有積極影響。而AMPA受體和KA受體介導(dǎo)Na+和Ca2+引起突觸后膜去極化，從而引起快速興奮性神經(jīng)傳導(dǎo)[4]。mGlu受體中mGluR1和mGluR5活化可加重腦組織損傷，而剩余的其他受體活化后則可減輕腦組織損傷[10]。另外，Glu轉(zhuǎn)運體在維持胞外Glu含量上具有重要作用，能夠迅速再攝取胞外Glu，從而維持較低的Glu含量。Glu轉(zhuǎn)運體主要分為囊泡Glu轉(zhuǎn)運體(VGLUTs)和質(zhì)膜型Glu轉(zhuǎn)運體(EAATs)。VGLUTs有三種亞型，其中VGLUT-1和VGLUT-2是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最主要的亞型，能夠?qū)⒓毎|(zhì)內(nèi)L-Glu轉(zhuǎn)運至囊泡內(nèi)，調(diào)節(jié)Glu隔離、儲存和釋放，進而影響突觸間隙Glu含量，影響Glu突觸傳遞[11]；EAATs有五種亞型，即GLAST/EAAT1、GLT-1/EAAT2、EAAC1/EAAT3、EAAT4和EAAT5，其中GLAST/EAAT1和GLT-1/EAAT2是最重要的膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)運體。GLT-1/EAAT2能夠重攝取絕大部分細胞外的Glu，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的Glu轉(zhuǎn)運體[12～14]。有研究顯示，興奮性毒性損傷與能量代謝障礙、氧自由基、一氧化氮和血小板活化因子有關(guān)[15]。主要原因是Glu含量過度增加導(dǎo)致的爆發(fā)性釋放和Glu清除障礙。

Glu爆發(fā)性釋放的毒性作用主要體現(xiàn)在以下幾方面：①急性滲透性損傷。由AMPA/KA受體過度興奮介導(dǎo)的急性損傷，可在數(shù)小時內(nèi)發(fā)生。腦缺血時突觸間隙過量的EAAs激活突觸后膜上AMPA/KA受體，使得Na+通道開放，Na+和Cl-內(nèi)流，導(dǎo)致細胞內(nèi)滲透壓上升，大量的水分由細胞外液進入細胞內(nèi)，造成細胞水腫和滲透性溶解。一般情況下，星形膠質(zhì)細胞最先發(fā)生水腫，從而延遲了神經(jīng)元水腫，起到限速細胞毒性腦水腫作用，但星形膠質(zhì)細胞的限速作用有限，一旦突破會引起嚴重腦水腫。②遲發(fā)性神經(jīng)元損傷。由NMDA受體過度興奮介導(dǎo)，數(shù)小時或數(shù)天內(nèi)發(fā)生[15]。腦缺血后，Ca2+依賴性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)釋放，但因細胞缺血缺氧逐漸引起能量喪失，導(dǎo)致Ca2+依賴性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)釋放無法維持，引起Na+內(nèi)流，K+外流，細胞膜內(nèi)外離子濃度嚴重失衡，進而非Ca2+依賴性的Glu轉(zhuǎn)運體翻轉(zhuǎn)[16，17]，引起神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的Glu向胞外釋放，使得細胞間隙的Glu蓄積，不僅導(dǎo)致缺血中心組織出現(xiàn)壞死，還可引起缺血區(qū)周圍神經(jīng)細胞出現(xiàn)緩慢壞死。過量的Glu可激活抑制型谷氨酸受體和代謝型谷氨酸受體，影響離子通道的正常功能，過度的Ca2+內(nèi)流引起神經(jīng)細胞壞死或凋亡，導(dǎo)致嚴重的腦缺血性損傷[18]。而Ca2+內(nèi)流使細胞內(nèi)Ca2+增多，可激活蛋白酶、磷脂酶、DNA酶等，使蛋白質(zhì)、磷脂等降解，產(chǎn)生花生四烯酸，在環(huán)氧酶2和5-脂氧酶催化下生成前列腺素和白三烯類，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。

當腦缺血時，蛋白激酶C和支架蛋白的激活可引起GLT-1/EAAT2從細胞膜至細胞內(nèi)再分布，加上溶酶體降解，從而導(dǎo)致其表達下調(diào)，引起Glu清除障礙[19]。有研究表明，敲除小鼠腦皮質(zhì)中GLT-1/EAAT2基因，其突觸釋放氨基酸的水平增加并且持續(xù)時間增長。另有研究利用腺病毒載體使GLT-1/EAAT2在大鼠腦皮質(zhì)局部過表達，發(fā)現(xiàn)其可顯著減少腦缺血導(dǎo)致的Glu外流、細胞凋亡并促進神經(jīng)功能恢復(fù)。因此，調(diào)控GLT-1/EAAT2有可能減輕腦缺血損傷[20，21]。

3 治療EAAs毒性損傷的藥物

基于腦缺血損傷的興奮性毒性機制，臨床上治療EAAs毒性損傷的藥物主要分為NMDA受體拮抗劑和Glu轉(zhuǎn)運體調(diào)節(jié)劑。NMDA受體拮抗劑是目前治療腦缺血損傷的主要藥物，如地佐環(huán)平、美金剛、右美托咪定、布美他尼和氧化槐定堿等。地佐環(huán)平可通過抑制鈣超載和刺激神經(jīng)干細胞增殖而保護神經(jīng)元，0.6 mg/kg干預(yù)即可減輕腦缺血大鼠EAAs對神經(jīng)元的毒性作用和內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖的影響，從而發(fā)揮神經(jīng)細胞保護作用[22]。美金剛20 mg/kg給予腦缺血大鼠，可顯著下調(diào)Caspase-3表達及NMDA生成，從細胞膜受損、功能障礙和細胞凋亡等環(huán)節(jié)上阻止神經(jīng)細胞損傷發(fā)生[23]。右美托咪定預(yù)處理腦缺血再灌注大鼠，再灌注后各時間點Glu、Asp含量和NMDAR1表達均較模型組明顯降低，提示右美托咪定可能通過抑制EAAs毒性損傷而發(fā)揮腦保護作用[24]。布美他尼30 mg/kg或氧化槐定堿250 mg/kg靜脈預(yù)給藥可降低腦水腫和NMDAR1表達，從而顯著抑制EAAs毒性，減輕大鼠腦缺血再灌注損傷[25，26]。

另外，通過調(diào)節(jié)Glu轉(zhuǎn)運體活性也可減輕興奮性毒性損傷，常用的Glu轉(zhuǎn)運體調(diào)節(jié)劑有囊泡型Glu轉(zhuǎn)運體抑制劑、質(zhì)膜型Glu轉(zhuǎn)運體激動劑兩類。囊泡型Glu轉(zhuǎn)運體抑制劑有偶氮類染料和玫瑰紅等染料類，犬脲氨酸和2，4-二羧酸喹啉等取代的喹啉類以及其他一些氨基酸、脂肪酸等，均有抑制囊泡型Glu轉(zhuǎn)運體的作用[11]。染料類抑制劑作用較強，但特異性較差，毒副作用較多；而喹啉類雖具有一定毒副作用，但其抑制作用特異性較好，具有較高的研發(fā)價值。質(zhì)膜型Glu轉(zhuǎn)運體激動劑有頭孢曲松、他莫西芬、17β-雌二醇等，可通過介導(dǎo)蛋白激酶A和NF-κB信號通路一條或兩條信號通路，激活Glu轉(zhuǎn)運體的活性或上調(diào)其表達，使突觸間隙的Glu被迅速清除，阻斷興奮性神經(jīng)毒性，減輕腦水腫程度，從而發(fā)揮腦保護作用[12，19，27]，但長期應(yīng)用頭孢曲松會損害大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶，需謹慎使用。近年大量研究表明，中藥及其復(fù)方制劑亦能抑制EAAs的釋放和下調(diào)NMDA受體表達，發(fā)揮神經(jīng)元保護作用，如芍藥甘草湯、夜交藤提取物、康腦液、芪棱湯、補陽還五湯和葛根素等[1,28～33]。

綜上所述，腦缺血損傷的發(fā)病機制復(fù)雜，一方面在發(fā)病時可能由一種或多種機制同時引起，另一方面在發(fā)病過程中往往伴隨一種或多種并發(fā)癥，這給臨床治療帶來了極大困難，而EAAs在腦缺血早期進程中發(fā)揮重要作用，并與Ca2+超載、能量代謝、細胞凋亡和炎癥反應(yīng)等過程相互影響。因此，了解EAAs在腦缺血損傷發(fā)生中的作用及其在腦組織中的動態(tài)變化規(guī)律，可為腦缺血損傷治療及藥物研發(fā)提供依據(jù)。