梁君偉，李青山，呂喜英，連相堯，劉蘭芳，方志華

(1 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000；2 承德市第三醫(yī)院)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率和死亡率明顯上升，并且呈現(xiàn)明顯年輕化趨勢(shì)，發(fā)病率位居城市女性惡性腫瘤第一位，嚴(yán)重威脅女性健康和生活質(zhì)量[1]。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未完全闡明，盡管手術(shù)和術(shù)后輔助治療取得明顯進(jìn)步，乳腺癌患者的預(yù)后有了一定的改善，但乳腺癌仍具有較高的復(fù)發(fā)率[2]。近年來國(guó)內(nèi)外研究[3]表明，二甲雙胍除了降糖作用外，還具有明顯抗腫瘤活性。體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲、遷移能力，使其成為目前腫瘤學(xué)領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)，但二甲雙胍抗乳腺癌方面的研究較少，并且作用機(jī)制尚不清楚。第10號(hào)染色體缺失性磷酸酶-張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)是目前公認(rèn)的抑癌基因之一，在包括乳腺癌在內(nèi)的眾多腫瘤中均起著明確的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[4]。研究[5，6]表明，上調(diào)PTEN基因的表達(dá)水平能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲，并促進(jìn)其凋亡。研究[7,8]發(fā)現(xiàn)，許多藥物或化學(xué)合成物能夠通過提高PTEN的表達(dá)水平從而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究觀察不同濃度的二甲雙胍對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3增殖、凋亡、侵襲及PTEN表達(dá)水平的影響，并探討二甲雙胍對(duì)乳腺癌細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 二甲雙胍、細(xì)胞及試劑 二甲雙胍原藥粉劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。人乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司，PTEN及內(nèi)參β-actin引物購(gòu)自廣州銳博生物公司， CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物公司，Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司，一抗PTEN、β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SK-BR-3細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d換液1次，細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，待融合度達(dá)90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 各組細(xì)胞增殖抑制率測(cè)算 采用CCK-8法。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SK-BR-3細(xì)胞接種于96孔板，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后棄原培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞。將SK-BR-3細(xì)胞分成4組，每組設(shè)5個(gè)平行孔，分別加入0、5、10、20 mmol/L的二甲雙胍，記為0 mmol/L組、5 mmol/L組、10 mmol/L組、20 mmol/L組。各組細(xì)胞置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液后繼續(xù)孵育3 h，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm 處的OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1-各組OD值450nm)/0 mmol/L組OD值450nm×100%。

1.4 各組細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染法。細(xì)胞分組及藥物干預(yù)方法同“1.3”，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，胰蛋白酶消化后以無血清培養(yǎng)基重懸制備單細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液置于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC，混合均勻后再加入5 μL PI，室溫避光反應(yīng)10 min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率。

1.5 各組細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分組及藥物干預(yù)方法同“1.3”，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，胰蛋白酶消化后以無血清培養(yǎng)基重懸制備單細(xì)胞懸液。Matrigel膠4 ℃過夜融化，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基按1:8稀釋后，均勻涂抹至Transwell小室上室的通透膜。取各組細(xì)胞制備的單細(xì)胞懸液，于Transwell小室上室分別加入200 μL含有2×105個(gè)細(xì)胞的無血清DMEM培養(yǎng)基，下室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，棉簽擦拭去上室的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，倒置、室溫風(fēng)干，0.1%結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下隨機(jī)取10個(gè)視野，計(jì)算穿過通透膜的細(xì)胞數(shù)目，以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力。

1.6 各組細(xì)胞PTEN mRNA檢測(cè) 采用qRT-PCR法。細(xì)胞分組及藥物干預(yù)方法同“1.3”，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，應(yīng)用TRIzol試劑按說明書操作提取細(xì)胞總RNA，取5 ng總RNA應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板，參照qRT-PCR試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)體系，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：PTEN上游引物為5′-TTGTGGCAACAGCTGAATCTGCAGTTGGCTAAGAGAGGTT-3′，下游引物為5′-ATGTAGCAAAACCCTTCGGAAACCTCTCTTA-GCCAACTGC-3′；內(nèi)參β-actin上游引物為5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物為5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct表示各組細(xì)胞中PTEN mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 各組細(xì)胞PTEN蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。細(xì)胞分組及藥物干預(yù)方法同“1.3”，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，PBS洗滌細(xì)胞，應(yīng)用預(yù)冷的蛋白裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min離心15 min后提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量法測(cè)定各組細(xì)胞蛋白濃度。按每孔50 μg蛋白上樣，10% SDS-PAGE電泳分離，蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂牛奶封閉2 h，分別加入合適濃度的一抗PTEN單克隆抗體(濃度1∶1 000)或β-actin單克隆抗體(濃度1∶3 000)，4 ℃搖床輕搖孵育過夜，漂洗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(濃度1∶5 000)，ECL化學(xué)發(fā)光、顯影、定影、壓片、灰度掃描，以灰度值表示PTEN蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，以β-actin 校正。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 0 mmol/L組、5 mmol/L組、10 mmol/L組、20 mmol/L組細(xì)胞增殖抑制率分別為0.0%±0.0%、23.7%±2.2%、43.2%±2.9%、63.9%±5.6%，組間相比，P均<0.05，提示二甲雙胍對(duì)SK-BR-3細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，且細(xì)胞增殖抑制作用具有一定的濃度依賴性。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 0 mmol/L組、5 mmol/L組、10 mmol/L組、20 mmol/L組細(xì)胞凋亡率分別為5.1%±0.2%、18.2%±1.9%、26.3%±2.0%、40.1%±2.6%，組間相比，P均<0.05，提示二甲雙胍對(duì)SK-BR-3細(xì)胞凋亡有明顯的促進(jìn)作用，且細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用具有一定的濃度依賴性。

2.3 各組細(xì)胞侵襲能力比較 0 mmol/L組、5 mmol/L組、10 mmol/L組、20 mmol/L組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(170±23)個(gè)、(112±14)個(gè)、(74±9)個(gè)、(30±5)個(gè)，組間相比，P均<0.05，提示二甲雙胍對(duì)SK-BR-3細(xì)胞侵襲能力有明顯的抑制作用，且細(xì)胞侵襲能力抑制作用具有一定的濃度依賴性。

2.4 各組細(xì)胞PTEN mRNA和蛋白表達(dá)比較 0 mmol/L組、5 mmol/L組、10 mmol/L組、20 mmol/L組細(xì)胞PTEN mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.04、2.89±0.27、4.12±0.23、5.45±0.49，PTEN蛋白的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.13±0.05、0.41±0.06、0.61±0.10、0.94±0.11，組間相比，P均<0.05，提示二甲雙胍能夠上調(diào)SK-BR-3細(xì)胞PTEN mRNA和蛋白的表達(dá)，且表達(dá)上調(diào)作用具有一定的濃度依賴性。

3 討論

研究[9]顯示，胰島素抵抗和高血糖癥明顯增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，特別是對(duì)于絕經(jīng)后合并體質(zhì)量超重的患者。研究[10]表明，合并糖尿病的乳腺癌患者生存期明顯短于未合并糖尿病的患者。二甲雙胍是目前臨床廣泛應(yīng)用的治療2型糖尿病的一線降糖藥物。近年來研究[11]證實(shí),二甲雙胍可降低2型糖尿病患者腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及腫瘤相關(guān)死亡率。在乳腺癌的研究[12]中也證實(shí)，二甲雙胍可降低2型糖尿病患者乳腺癌的發(fā)病率。Jiralerspong等[13]發(fā)現(xiàn)，合并糖尿病的乳腺癌患者，服用二甲雙胍患者的預(yù)后明顯優(yōu)于未服用二甲雙胍者，但至今二甲雙胍對(duì)乳腺癌發(fā)生及預(yù)后影響的具體作用機(jī)制尚未明確。

乳腺細(xì)胞的異常增生、凋亡受阻、侵襲增強(qiáng)是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生發(fā)展的主要因素。抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲并誘導(dǎo)其凋亡，是目前藥物治療惡性腫瘤重要的作用機(jī)制之一。近年有研究[14]證實(shí)，二甲雙胍能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)和增殖，并且能夠減小荷瘤裸鼠的腫瘤體積，且對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞不產(chǎn)生破壞作用，在抗腫瘤方面具有很大的應(yīng)用前景，引起了學(xué)者的關(guān)注。但二甲雙胍對(duì)乳腺癌生長(zhǎng)、侵襲影響的研究較少。本研究用不同濃度的二甲雙胍處理人乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞后，檢測(cè)結(jié)果顯示，二甲雙胍對(duì)SK-BR-3細(xì)胞的增殖和侵襲有著明顯的抑制作用，對(duì)SK-BR-3細(xì)胞的凋亡有著明顯的促進(jìn)作用，提示二甲雙胍對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有著明顯抑制作用，并且這些作用都具有一定的濃度依賴性，隨著二甲雙胍濃度的增高，作用逐漸增強(qiáng)。

目前有關(guān)二甲雙胍對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)侵襲抑制作用的具體作用機(jī)制尚不清楚。近年研究[15,16]發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍在胃癌、腎細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤中可以上調(diào)PTEN的表達(dá)而發(fā)揮抑癌基因的作用。PETN基因位于染色體10q2313上，含有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，是至今發(fā)現(xiàn)的惟一具有磷酸酶活性和蛋白脂酶活性的抑癌基因。研究[17]發(fā)現(xiàn),PETN能夠通過調(diào)控PI3K/AKT、FAK/P130CAS、SHC/Gab、P53/MDM2、PRAP/mTOR、RAS/ERK等機(jī)體多個(gè)重要信號(hào)通路，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲和遷移的調(diào)控。研究[18]顯示，50%的乳腺癌患者存在PTEN基因缺失、突變或者啟動(dòng)子甲基化。Stambolic等[19]在研究中發(fā)現(xiàn)，條件性敲除PTEN基因的雌性小鼠，49%在6個(gè)月后發(fā)生乳腺癌。提高乳腺癌細(xì)胞PTEN基因的表達(dá)水平能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲遷移，并促進(jìn)其凋亡[20]。在對(duì)耐藥性乳腺癌細(xì)胞的研究[21]中發(fā)現(xiàn)，提高PTEN基因的表達(dá)可以明顯提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物阿霉素的敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠明顯上調(diào)乳腺癌細(xì)胞PTEN mRNA和蛋白的表達(dá)，并且對(duì)PTEN mRNA和蛋白表達(dá)的上調(diào)作用具有一定的濃度依賴性，隨著二甲雙胍濃度的增高，作用逐漸增強(qiáng)，說明二甲雙胍能夠通過上調(diào)PTEN基因的表達(dá)水平發(fā)揮抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)侵襲的作用。

綜上所述，二甲雙胍能夠明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，促進(jìn)其凋亡，對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)起著明顯的抑制作用，并且抑制作用與二甲雙胍濃度有關(guān)，其機(jī)制可能與上調(diào)PTEN的表達(dá)有關(guān)。