郭國(guó)賢，張秀芹，苗 翠，侯廣正，徐麗佳

（遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，沈陽(yáng) 110016）

酶聯(lián)免疫試劑盒（ELISA）作為一種測(cè)定獸藥殘留的重要手段，是以免疫學(xué)反應(yīng)為根底的。其基本原理是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，顯色后用酶標(biāo)儀在固定波長(zhǎng)下讀出吸光度值。由于酶的催化效率很高，間接放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到較高敏感度[1]。ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。所以ELISA方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快、儀器化程度低、檢測(cè)速度快、樣本前處理簡(jiǎn)單、價(jià)格低和適于開發(fā)成攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)，已成為我國(guó)獸藥殘留檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控、大量樣本篩查的主要方法[2]。

目前，酶聯(lián)免疫試劑盒技術(shù)發(fā)展迅猛，用于獸藥殘留篩查的試劑盒品種幾乎涵蓋日常監(jiān)控的所有品種，但試劑盒的產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，市場(chǎng)準(zhǔn)入門檻低、監(jiān)管相對(duì)匱乏，導(dǎo)致現(xiàn)在市面上試劑盒廠家繁多，質(zhì)量參差不齊，且目前也沒有一種系統(tǒng)的評(píng)價(jià)方法對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，部分產(chǎn)品與同類產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)中過(guò)分追求價(jià)格取勝，而不重視產(chǎn)品質(zhì)量。為了能夠客觀、公正地對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，參考農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]17號(hào)文中的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。本文對(duì)遼寧省市面上銷售的多家試劑盒廠家的多個(gè)品種進(jìn)行了對(duì)比，簡(jiǎn)單介紹試劑盒對(duì)比實(shí)驗(yàn)的總體思路，以及在實(shí)驗(yàn)和日常使用過(guò)程中所遇到的一些問(wèn)題。

1 試劑盒對(duì)比實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑盒檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性

檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性主要是通過(guò)對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)真假陽(yáng)性的判斷來(lái)決定的，作為一個(gè)初篩的手段，能夠正確判斷樣品的陰陽(yáng)性是試劑盒的最重要功能，使用同一品牌同一批號(hào)的試劑盒，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，重復(fù)測(cè)定20次有代表性的不同個(gè)體的空白樣品，計(jì)算這些樣品的平均值以及樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差，均值加上3倍樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差即為該試劑盒在本實(shí)驗(yàn)室的檢出限，以此為判定依據(jù)，以不出現(xiàn)假陰性，假陽(yáng)性控制在5%以內(nèi)作為整體對(duì)比試驗(yàn)判分的基礎(chǔ)[5]。未通過(guò)試驗(yàn)的試劑盒產(chǎn)品絕大多數(shù)都是出現(xiàn)了假陰性結(jié)果或者出現(xiàn)多個(gè)假陽(yáng)性的結(jié)果。

假陰性或者假陽(yáng)性的出現(xiàn)有多種原因，有人為的錯(cuò)誤操作，例如移液槍使用不當(dāng)造成的加樣不準(zhǔn)確、槍頭產(chǎn)生氣泡；試劑盒反應(yīng)溫度不夠、反應(yīng)時(shí)間不準(zhǔn)確；試劑盒未徹底回溫等。也有試劑盒產(chǎn)品的質(zhì)量問(wèn)題，例如試劑盒內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品不準(zhǔn)確、抗原抗體包被不均勻等。其中有一個(gè)容易疏忽的問(wèn)題，就是在瘦肉精類盒子中適用基質(zhì)的問(wèn)題，瘦肉精類盒子根據(jù)適用的基質(zhì)不同，分為組織類與動(dòng)物尿液類，而常用的動(dòng)物尿液的試劑盒又分為豬尿、牛尿等。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)某些試劑盒雖然標(biāo)明適用基質(zhì)為動(dòng)物尿液，但實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)牛尿的假陽(yáng)性率過(guò)高，因?yàn)椴煌瑒?dòng)物的尿液以及不同地域的樣品都存在著顯著差異，這種情況在后期使用過(guò)程中也同時(shí)出現(xiàn)了。后來(lái)試劑盒廠家針對(duì)自己的產(chǎn)品，紛紛做出相應(yīng)的調(diào)整，有些廠家將適用基質(zhì)由原來(lái)的動(dòng)物尿液改為適用于豬尿，而有些廠家則通過(guò)修改前處理方法，增加尿液的稀釋步驟，來(lái)避免出現(xiàn)基質(zhì)干擾。在后期的使用過(guò)程以及試劑盒比對(duì)試驗(yàn)中，就未出現(xiàn)大范圍的假陽(yáng)性率。因此，在選用試劑盒的時(shí)候一定要結(jié)合使用情況以及當(dāng)?shù)貥颖净|(zhì)的特點(diǎn)來(lái)選用適宜的試劑盒。

1.2 試劑盒產(chǎn)品的精密度和準(zhǔn)確度

試劑盒產(chǎn)品的準(zhǔn)確度和精密度主要體現(xiàn)在測(cè)定平行樣品的變異系數(shù)。在試劑盒對(duì)比試驗(yàn)中，用同一個(gè)實(shí)驗(yàn)人員測(cè)定同一廠家同一型號(hào)的3個(gè)不同批次的試劑盒，分別測(cè)定定量限、2倍定量限兩種樣品，每個(gè)試劑盒測(cè)定平行樣品6次，用來(lái)計(jì)算每批試劑盒的3批的批內(nèi)內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)[4]。由于ELISA試劑盒是以免疫學(xué)反應(yīng)為根底的，所以抗原包被不均一、抗原與抗體結(jié)合不穩(wěn)定、底物顯色不徹底、生產(chǎn)工藝等因素都會(huì)影響試劑盒產(chǎn)品的穩(wěn)定性。使用同一個(gè)熟練操作的實(shí)驗(yàn)人員測(cè)定同一廠家同一品種的3批次試劑盒，來(lái)盡量排除人為因素的影響，最后得出的分值就可以看出試劑盒產(chǎn)品的準(zhǔn)確度與精密度。從對(duì)比試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，結(jié)果較好的試劑盒該部分得分總體較高，也就是說(shuō)該項(xiàng)評(píng)價(jià)總體與試劑盒的質(zhì)量成正比。

1.3 檢測(cè)結(jié)果的回收率

一些試劑盒回收率不穩(wěn)定，參與實(shí)驗(yàn)的試劑盒最低的回收率有16.8%，最高的有817.8%，雖然在判定結(jié)果是以實(shí)驗(yàn)室實(shí)際計(jì)算出的檢出限為計(jì)，但回收率如果過(guò)高或者過(guò)低還是會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。過(guò)高的回收率不排除某些廠家為了避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)而調(diào)高反應(yīng)率，而回收率過(guò)低，則可能與試劑盒所提供的樣本提取液、抗原、抗體、酶結(jié)合物、底物等因素有關(guān)。雖然該項(xiàng)不是決定性指標(biāo)，但根據(jù)近些年的數(shù)據(jù)來(lái)看，結(jié)果較好的試劑盒回收率通常較好而且比較穩(wěn)定。

2 試劑盒使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題

2.1 試劑盒產(chǎn)品的檢出限設(shè)定不科學(xué)

在日常使用過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)有些試劑盒的檢出限設(shè)定的很低，甚至遠(yuǎn)低于自身產(chǎn)品的檢測(cè)能力。檢出限定低了，假陽(yáng)性勢(shì)必會(huì)增加。為了突出自身產(chǎn)品的性能，使其在競(jìng)爭(zhēng)中能夠脫穎而出，有些廠家故意壓低檢出限，甚至超出自身產(chǎn)品所能達(dá)到的能力范圍。對(duì)于某一具體藥物和具體樣本來(lái)說(shuō)，并非試劑盒檢出限越低越好，理想狀態(tài)是試劑盒檢測(cè)范圍，也就是標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的中間值與該藥物在某一樣本的“超標(biāo)值”或“陽(yáng)性值”近，這樣既可以減少誤差，又方便用戶對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定[1]。所以，在日常選用試劑盒的過(guò)程中，并不是檢出限越低試劑盒就越好，而是結(jié)合樣本的“超標(biāo)值”或“陽(yáng)性值”以及試劑盒的曲線范圍來(lái)選取最適宜的試劑盒。而廠家在設(shè)定產(chǎn)品的檢出限時(shí)，也應(yīng)結(jié)合樣本的“超標(biāo)值”或“陽(yáng)性值”以及自身產(chǎn)品能力來(lái)設(shè)定適宜的檢出限。

2.2 樣品前處理過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題

對(duì)于硝基呋喃類藥物殘留的測(cè)定，因?yàn)橄趸秽惪股貙?duì)光敏感，具有代謝快速的特點(diǎn)，在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期僅為幾小時(shí)，在檢測(cè)硝基呋喃類藥物殘留檢測(cè)時(shí)，通常不易檢出原藥殘留。例如呋喃唑酮在停藥后12 h內(nèi)從組織中消失，而其代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮（AOZ）在動(dòng)物體內(nèi)則以組織蛋白結(jié)合物的形式存在，在體內(nèi)可殘留數(shù)軸。因此當(dāng)原藥濃度將至檢測(cè)限以下時(shí)，一般檢測(cè)其在體內(nèi)的代謝物，所以需對(duì)其進(jìn)行衍生[5]。在試劑盒測(cè)試過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，有些廠家在說(shuō)明書中標(biāo)明了兩種衍生的方式，一種是室溫衍生16 h，一種是60℃衍生1.5 h的快速衍生。實(shí)際操作發(fā)現(xiàn)，使用快速衍生的檢測(cè)結(jié)果不如使用16 h室溫衍生的檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定。雖然高溫衍生用時(shí)短，但考慮到實(shí)驗(yàn)室自身?xiàng)l件以及結(jié)果，室溫16 h的衍生方法還是相對(duì)穩(wěn)定的。

2.3 日常使用過(guò)程中應(yīng)注意的細(xì)節(jié)

試劑盒儲(chǔ)存及反應(yīng)溫度的控制：試劑盒的儲(chǔ)存一般都存放在冷藏室（2～8℃），如果溫度過(guò)低，可能會(huì)導(dǎo)致酶失活。在使用前，一定要回溫，特別是微孔板、洗滌液、標(biāo)準(zhǔn)品、復(fù)溶液等盒內(nèi)材料與試劑，應(yīng)在使用前取出并按說(shuō)明書操作回溫[6]。在使用過(guò)程中，也應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)室溫度，一般來(lái)說(shuō)應(yīng)控制在25℃，如室溫達(dá)不到要求，則在試劑盒反應(yīng)過(guò)程中，應(yīng)放置在25℃烘箱中進(jìn)行。溫度過(guò)低，試劑盒可能會(huì)出現(xiàn)顯色不徹底，而溫度過(guò)高，顯色過(guò)深同樣影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

試劑盒使用過(guò)程中移液器應(yīng)注意的細(xì)節(jié)：在移液器的使用過(guò)程中，應(yīng)該注意以下細(xì)節(jié)：加樣過(guò)程中應(yīng)避免移液槍槍頭出現(xiàn)氣泡，在使用單槍進(jìn)行加樣的時(shí)候，盡量選取吸一打二的方式，使用排槍的時(shí)候，應(yīng)盡量使用吸二打一的方式來(lái)避免出現(xiàn)加樣量不準(zhǔn)確的情況。同時(shí)在加樣過(guò)程中，槍頭不能觸碰反應(yīng)孔壁。

在將液體加入酶標(biāo)孔中后，應(yīng)將酶標(biāo)板放置在平整的桌子上，輕微震蕩，使孔內(nèi)液體充分混勻。在反應(yīng)過(guò)程中，要蓋好蓋板膜，提供避光環(huán)境，并且防止孔內(nèi)液體揮發(fā)。

在洗板過(guò)程中，每次加入洗液時(shí)應(yīng)輕微震蕩，并且放置約20 s，并且在傾倒孔內(nèi)液體的過(guò)程中，應(yīng)避免出現(xiàn)其中一個(gè)酶標(biāo)孔內(nèi)的液體流入另一酶標(biāo)孔中造成的交叉污染。洗板完畢后，應(yīng)注意觀察反應(yīng)孔中是否含有氣泡，如含有氣泡，應(yīng)用干凈的移液槍頭將氣泡挑去，但在挑氣泡的過(guò)程中，不能觸碰孔壁及孔底。

因?yàn)槊嘎?lián)免疫試劑盒的終止液一般為2 mol·L-1的鹽酸，具有較強(qiáng)的腐蝕性，所以在加入終止液時(shí)，應(yīng)注意終止液不能接觸皮膚以及衣物，如不小心接觸皮膚，應(yīng)及時(shí)用大量清水沖洗。

在配置樣本提取液、稀釋液、洗液等試劑盒不提供的液體時(shí)，如需配置水溶液的話，必須使用去離子水。因?yàn)樽詠?lái)水或者礦物質(zhì)水中可能含有能干擾酶標(biāo)板測(cè)定的金屬離子以及礦物質(zhì)鹽類。

酶聯(lián)免疫試劑盒是通過(guò)最終使用酶標(biāo)儀讀取吸光度值來(lái)進(jìn)行測(cè)定的，所以在使用酶標(biāo)儀讀數(shù)前，應(yīng)提前打開酶標(biāo)儀，使酶標(biāo)儀內(nèi)燈預(yù)熱＞30 min，使酶標(biāo)儀狀態(tài)穩(wěn)定[7]。

3 小結(jié)

近年來(lái)，酶聯(lián)免疫試劑盒發(fā)展迅速，試劑盒的質(zhì)量、操作便利程度等均在穩(wěn)步提升，但由于地區(qū)差異、樣品差異及試劑盒廠家種類繁多，所以在選用試劑盒的時(shí)候，還是建議對(duì)試劑盒的適用基質(zhì)、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、檢出限等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行考察，以避免出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性的現(xiàn)象發(fā)生。