朱生琳，朱蓉，趙逵

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000)

結(jié)腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其病死率位居癌癥的第3位[1,2]。隨著我們國家日新月異的經(jīng)濟發(fā)展和生活習(xí)慣的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢，因此對結(jié)腸癌的防治研究迫在眉睫。腫瘤干細胞(CSC)是腫瘤少量具有自我更新、多向分化潛能及無限增殖和異質(zhì)性的細胞亞群[3]，可為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及為最新的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。Wnt信號通路對細胞發(fā)育分化、修復(fù)起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，是細胞生長、分化的起始信號。Wnt信號通路主要有Wnt/β-catenin、Wnt/PCP、Wnt/calcium 3種傳導(dǎo)方式[4]，其中Wnt/β-catenin是經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)通路，主要調(diào)控細胞的增殖能力。大量研究表明，經(jīng)典Wnt信號通路參與CSC的分子調(diào)控，破譯其關(guān)系也許可以從根源上遏制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，對腫瘤防治有重要意義。本文就經(jīng)典Wnt信號通路與結(jié)腸CSC存在的信號級聯(lián)關(guān)系綜述如下。

1 經(jīng)典Wnt信號通路對結(jié)腸CSC生成的調(diào)控

研究認(rèn)為，CSC可能來源于干細胞發(fā)生特定的基因突變，成為具有無限增殖能力的異質(zhì)性細胞。大量實驗顯示，在自我更新和多向分化潛能方面，腸道干細胞(ISC)與結(jié)腸CSC具有類似的生物學(xué)特性。例如，二者有相同的標(biāo)記物L(fēng)gr5、CD133、CD44。結(jié)腸干細胞在腸道隱窩基底部沿著“隱窩”-“絨毛”軸不斷的分化向上遷移，從而維持了腸道組織的穩(wěn)態(tài)平衡和自我更新；并且，研究發(fā)現(xiàn)β-catenin在結(jié)腸隱窩基底部的表達最強，并沿著“隱窩”-“絨毛”軸由強漸弱[5]。因此，經(jīng)典Wnt信號通路對于ISC調(diào)控細胞的起始增殖分化有著重要的作用。研究顯示，敲除轉(zhuǎn)基因新生小鼠的T細胞轉(zhuǎn)錄因子4(TCF4)、選擇性抑制轉(zhuǎn)基因小鼠中經(jīng)典Wnt通路的激活，或者選擇性切除β-catenin或TCF4片段，都可使腸道隱窩內(nèi)ISC銳減。因此，隱窩內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和ISC自我更新都離不開經(jīng)典Wnt通路的激活傳導(dǎo)[6～8]。

CSC是構(gòu)成腸道腫瘤組織的一小部分，其角色相當(dāng)于正常組織里面的ISC，而CSC就相當(dāng)于腫瘤細胞起始的“種子”。根據(jù)其相似的生理功能，在腸道中提出了“自上而下”和“自下而上”兩種假設(shè)模型?！白陨隙隆蹦Ｐ驼J(rèn)為，結(jié)腸CSC是由部分已分化的細胞重新獲得類干細胞樣的特性，發(fā)展為腫瘤并在隱窩部產(chǎn)生異常病灶；“自下而上”模型認(rèn)為，結(jié)腸CSC是隱窩基底部的干細胞發(fā)生基因突變，向外擴、張向上遷徙成為腫瘤的起始“種子”。這兩種模型都受經(jīng)典Wnt信號通路的調(diào)控：①在“自上而下”模型中，超活化的β-catenin-TCF信號可使分化的腸道上皮重新獲得多能性，從而形成新的不受調(diào)控的類隱窩結(jié)構(gòu)，隨后發(fā)生腺瘤[9]。在結(jié)腸頂端早期腺瘤的觀察中發(fā)現(xiàn)，已分化細胞是結(jié)腸CSC致瘤性轉(zhuǎn)化的“種子”起源細胞；在腸道腫瘤的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中顯示，已分化的上皮細胞具有能重新獲得類干細胞樣的功能[10]，通過聯(lián)合激活經(jīng)典Wnt通路和核因子κB(NF-κB)信號可獲得腫瘤細胞特性[11]。②在“自下而上”模型中，對早期散發(fā)的結(jié)腸腺瘤免疫組化研究顯示，腺瘤病變部位靠近隱窩基底部，病變部位β-catenin在核內(nèi)的積聚，維持了其對應(yīng)的表皮細胞β-catenin在亞膜間隙的連接[12]。在結(jié)腸腺瘤性息肉病基因(APC)缺失的結(jié)腸隱窩基底部干細胞，可被迅速誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為結(jié)腸微腺瘤。這表明增加Lgr5+干細胞艙中經(jīng)典Wnt的活性，可誘發(fā)產(chǎn)生結(jié)腸CSC[13]。以上研究都表明，經(jīng)典Wnt信號過度活化是干細胞艙中致瘤性轉(zhuǎn)化至關(guān)重要的因素，而腸道上皮在慢性炎癥等條件下增加NF-κB信號也同樣可使細胞去分化。另外，由于經(jīng)典Wnt信號通路的過度活化，也可導(dǎo)致隱窩基底部的ISC產(chǎn)生基因突變轉(zhuǎn)化為腸道CSC。

2 Lgr5是經(jīng)典Wnt信號通路誘導(dǎo)結(jié)腸CSC產(chǎn)生的標(biāo)志

Lgr5是經(jīng)典Wnt信號通路的靶基因，同時也是ISC和CSC常見的表面標(biāo)記[14]。在小鼠結(jié)腸癌模型的研究中顯示，在經(jīng)典Wnt信號通路過度活化(敲除APC基因)模型中，腸道中的Lgr5+亞群導(dǎo)致了結(jié)腸腺瘤的形成[15,16]。因此，Lgr5+細胞被認(rèn)為是腫瘤的初始細胞。在實驗中結(jié)合ISC所具有的生物特性，可通過Lgr5細胞表面標(biāo)記物，將結(jié)腸CSC從結(jié)直腸癌(CRC)組織中分離出來。高表達Lgr5的CRC細胞在試管中的增殖具有更強的克隆能力，而抑制Lgr5的表達會導(dǎo)致其喪失形成集落的能力[17]。高水平的Lgr5-ISC腫瘤基因特性是更具侵襲和轉(zhuǎn)移能力，也揭示了CRC患者的高復(fù)發(fā)趨勢[18]。在19種公認(rèn)的干細胞標(biāo)記中，Lgr5在人體CRC樣本中有74%普遍表達率，Lgr5和Ascl2以及其他基因一起共表達，印證了腺瘤來源于Lgr5+/Ascl2+隱窩干細胞這一假設(shè)。對CRC經(jīng)手術(shù)治療復(fù)發(fā)患者的研究顯示，Wnt信號通路靶基因(Lgr5、Ascl2、Axin2、Dkkl和Apcdd1)的表達與疾病復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)，經(jīng)典Wnt信號通路靶基因高表達與良好的預(yù)后密切相關(guān)[17]?；趯RC細胞系的研究發(fā)現(xiàn)，這些經(jīng)典Wnt靶基因可被CpG甲基化選擇性沉默。因此，在結(jié)腸CSC中經(jīng)典Wnt靶基因甲基化，可導(dǎo)致CRC復(fù)發(fā)概率增高。

3 由經(jīng)典Wnt信號通路誘發(fā)的結(jié)腸CSC參與CRC的轉(zhuǎn)移

研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織侵襲前細胞核中表達出高水平β-catenin。這些細胞是通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)而來的，具有更強的增殖能力和侵襲力，意味著經(jīng)典Wnt信號通路誘導(dǎo)CSC在轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色。大量研究表明，EMT在CSC增殖中起著關(guān)鍵的管理調(diào)控機制，尤其表現(xiàn)在乳腺癌細胞系中。同樣的在CRC中，EMT影響著其惡性程度與遠端轉(zhuǎn)移，包括結(jié)腸CSC的增殖、腫瘤的發(fā)育、循環(huán)腫瘤細胞以及耐藥性[19]。結(jié)腸CSC具有的自我更新和分化能力，使其可以更好地去調(diào)節(jié)適應(yīng)腫瘤轉(zhuǎn)移的各種不同階段。在具有過度活化的經(jīng)典Wnt信號通路的晚期結(jié)腸腫瘤CSC細胞中發(fā)現(xiàn)，Lgr5的表達與CRC腫瘤細胞株的惡性潛能聯(lián)系密切。在高表達的Lgr5結(jié)腸腫瘤中，其腫瘤分期越高、侵襲性更強、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移概率更大[20]。隨著研究的深入，“遷徙腫瘤干細胞(MCSCs)”假設(shè)被提出，由結(jié)腸CSC參與的結(jié)腸腫瘤轉(zhuǎn)移是轉(zhuǎn)移的主要驅(qū)動力[21,22]。根據(jù)該實驗?zāi)Ｐ?，結(jié)腸CSC內(nèi)在的適應(yīng)性導(dǎo)致了結(jié)腸癌獲得更強的侵襲性，可通過血液以及淋巴管遷徙至遠端的器官，從而發(fā)展至腫瘤晚期階段。新形成的轉(zhuǎn)移瘤和同源的原位癌有著高度相似基因和蛋白，這表明定植后的MCSCs可重新轉(zhuǎn)化為它們最初的表型[23]。在與具有原位CRC細胞組織和肝轉(zhuǎn)移患者的基因表達中發(fā)現(xiàn)，Ascl2在轉(zhuǎn)移瘤以及一些經(jīng)典Wnt信號通路誘導(dǎo)的ISC中表達上調(diào)，其他還包括Lgr5、EphB3、Ets2、Smoc2[24]和Sox9[23]。

4 以經(jīng)典Wnt信號通路為靶點抑制結(jié)腸CSC

在靶向藥物的研究中，我們可從4個方面來調(diào)控經(jīng)典Wnt信號通路繼而影響結(jié)腸CSC的增殖、分化與轉(zhuǎn)移。①在細胞外及細胞膜方面，激活經(jīng)典Wnt信號通路可以影響Wnt配體、Fzd、LRP5/6、Wnt抑制因子、dikkopf以及Frizzled家族分泌蛋白的表達水平。②在細胞質(zhì)方面，通過干預(yù)APC、Axin、β-catenin以及激活狀態(tài)的環(huán)氧化酶(COX)-2的表達水平，可以影響β-catenin在細胞內(nèi)的累積量和穩(wěn)定性。③在細胞核方面，LEF/TCF的轉(zhuǎn)錄、AMP應(yīng)答因子結(jié)合蛋白CBP、c-myc以及D1同樣調(diào)控結(jié)腸CSC的增殖和分化。④其他信號通路同樣也能作用于經(jīng)典Wnt信號通路，對結(jié)腸CSC產(chǎn)生不同程度的影響。

非甾體抗炎藥(NSAIDs)已經(jīng)證實對于腫瘤具有抑制作用，并且已成為重要的結(jié)腸癌化療藥物。其作用機制主要是通過抑制COX中的關(guān)鍵信號花生四烯酸，但不同的NSAIDs抑癌機制不同。例如，阿司匹林、塞來昔布通過抑制經(jīng)典的Wnt信號通路發(fā)揮抑癌作用。塞來昔布選擇性抑制COX-2，并且在經(jīng)典Wnt信號通路中降低TCF，這一機制被用于治療家族性腺瘤息肉病。近年來，研究發(fā)現(xiàn)使用塞來昔布的APC患者中70%可降低腸息肉的形成[25]，這給結(jié)腸癌的治療指出新方向。實驗中NSAIDs能夠誘導(dǎo)人結(jié)腸息肉細胞凋亡，并在APCMin/+小鼠[26]中能夠有效清除ISC的異常Wnt信號。其機制是激活A(yù)PC缺失細胞中的Bcl-2同源結(jié)構(gòu)3域，相繼導(dǎo)致c-myc的激活[27]，進一步揭示了NSAIDs在腫瘤中可誘發(fā)凋亡信號。

綜上所述，經(jīng)典Wnt信號通路對體內(nèi)動態(tài)平衡和發(fā)展起著重要的作用，參與生長發(fā)育、分化等多種復(fù)雜的生理過程；該通路同樣也是ISC的主要調(diào)控器，對腸道腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著至關(guān)重要的作用?，F(xiàn)階段在結(jié)腸干細胞基礎(chǔ)上提出了CSC理論，并發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt信號通路和CSC及Lgr5、Ascl2、Axin2、Dkkl和Apcdd1等多種經(jīng)典Wnt信號通路靶基因及CSC標(biāo)記的表達與腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)存在關(guān)聯(lián)。但是，腸道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移是連續(xù)性、多環(huán)節(jié)、多過程的生化過程，其作用機制至今尚未明確，有待進一步的研究和探索。

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