李袁靜，高凌云，楊昌軍，蔡明

(1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，重慶400006；2美國俄亥俄州立大學(xué)心肺研究中心)

血管平滑肌細(xì)胞是一類具有高度特異性的細(xì)胞,主要功能是通過收縮和舒張作用調(diào)節(jié)血管腔大小，進(jìn)而影響血流量及血壓，其舒縮調(diào)控機(jī)制與細(xì)胞肌球蛋白輕鏈(MLC) 第19號絲氨酸的磷酸化水平相關(guān)。已經(jīng)證實(shí)，肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)磷酸化作用對機(jī)體血壓的調(diào)節(jié)有重要影響[1]。但除MLCK外，越來越多的研究表明還存在對細(xì)胞MLC有磷酸化作用的其他激酶存在。當(dāng)平滑肌細(xì)胞缺乏促收縮因素或使用MLCK抑制劑，細(xì)胞內(nèi)仍有較低水平的MLC磷酸化。IκB激酶2(IKK2)是NF-κB活化的重要激酶[2,3]，可磷酸化多種底物并參與細(xì)胞增殖、遷移、胰島素敏感性改變等多種細(xì)胞反應(yīng)[4,5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，IKK2抑制劑包括化學(xué)物或抑制肽均有血管舒張作用，IKK2對血壓改變可能有重要影響。為尋找高血壓防治新靶點(diǎn)，2014年12月～2016年3月，我們就IKK2對血管舒縮的調(diào)控作用進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料 16周齡SD大鼠(重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)獲重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會審核)，MLC小鼠抗體(Ser19，Cell Signaling Technology)，抗MLC小鼠抗體(Sigma)，兔抗IkBa(Cell Signaling Technology)，actin單克隆抗體(Sigma)，flag小鼠抗體(Sigma)，兔抗IKK2(Sigma)，兔抗IKK1(Sigma)，兔抗Zip激酶(Abcam),兔抗ILK(Abcam)，小鼠抗NEMO(Cayman Chemicals)，小鼠抗磷酸化IkBa(Ser32/36，Cell Signaling Technology)，小鼠抗RhoA(BD Transduction Laboratories)和兔抗IKKα/β(Ser176/Ser180，Cell Signaling Technology)，HTScan激酶測量試劑盒(Cell signaling technology)。

1.2 去內(nèi)皮胸主動(dòng)脈環(huán)制備 將SD大鼠用戊巴比妥鹽水麻醉，迅速切取胸主動(dòng)脈并用 PSS洗凈。將主動(dòng)脈切成2 mm寬環(huán)狀，并通過機(jī)械摩擦的方式移除血管內(nèi)皮。血管環(huán)用兩根不銹鋼微型掛鉤貫穿血管管腔，水平懸掛于10 mL浴漕內(nèi)，下方固定，上方以一細(xì)鋼絲連于張力換能器，經(jīng)Multi Myograph System計(jì)算機(jī)生物信號采集分析系統(tǒng)記錄血管的張力變化。每個(gè)血管環(huán)懸掛于浴管(浴管內(nèi)含有95% O2和5% CO2、37 ℃的PSS液10 mL)后，基礎(chǔ)張力調(diào)至30 mN，平衡1 h。動(dòng)脈環(huán)用80 mmol/L KCl液多次刺激。當(dāng)達(dá)到坪值后，加入乙酰膽堿(10 μmol/L)。舒張幅度不超過收縮幅度的5%時(shí)，認(rèn)為胸主動(dòng)脈內(nèi)皮去除完全。

1.3 IKK2抑制劑對胸主動(dòng)脈環(huán)舒張效應(yīng)檢測 觀察除血管內(nèi)皮的大鼠主動(dòng)脈環(huán)由血管收縮劑(去氧腎上腺素、KCl、U-46619、離子霉素、花萼海綿體誘癌素A)預(yù)處理，然后分別加入10 μmol/L IMD0354、30 μmol/L SC-514。設(shè)置IKK2抑制多肽對照組。采用Multi Myograph System計(jì)算機(jī)生物信號采集分析系統(tǒng)記錄血管張力變化。

1.4 MLCK抑制劑對IKK2磷酸化影響檢測 將MCL與1 mmol/L的EGTA(為MLCK抑制劑)或?qū)φ战M中分別加入25 nmol/L的IKK2、25 nmol/L的MLCK共孵育1 h，通過Western blotting檢測MLC第19號絲氨酸的磷酸化水平。

1.5 IKK2抑制劑SC-514的舒血管效應(yīng)可逆性檢測 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)制備的動(dòng)脈血管環(huán)預(yù)先使用去氧腎上腺素1 μmL處理，然后用SC-514舒張血管。設(shè)置IKK2抑制劑SC-514組和空白對照組。充分沖洗后，經(jīng)Multi Myograph System計(jì)算機(jī)生物信號采集分析系統(tǒng)記錄血管張力變化。

2 結(jié)果

2.1 IKK2抑制劑對胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張效應(yīng) IMD-035為IKK2選擇性抑制劑，其對KCl、去氧腎上腺素、U-46619、離子霉素、花萼海綿體誘癌素A縮血管預(yù)處理的動(dòng)脈作用10 min后，血管張力分別為55.3%±1.2%、47.0%±3.5%、61.2%±4.4%、37.5%±1.9%、41.0%±2.7%，與對照組(7.4%±0.9%)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。SC-514是IKK2的競爭性抑制劑，對去氧腎上腺素和KCL預(yù)處理的動(dòng)脈同樣有舒血管效應(yīng)，血管張力分別為48.7%±3.9 %、32.1%±2.8% ，與對照組(9.4%±1.1%)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。

2.2 MLCK抑制劑對IKK2磷酸化的影響 對照組、MLCK組、IKK2組、EGTA組、MLCK聯(lián)合EGTA組、IKK2聯(lián)合EGTA組MLC磷酸化水平分別為1.04±0.03、1.96±0.03、1.72±0.07、0.61±0.03、1.06±0.04、1.70±0.03。MLC在MLCK 、IKK2作用下磷酸化程度增加，EGTA可降低MLCK對MLC的磷酸化水平，IKK2對對MLC的磷酸化活性不被EGTA所抑制。組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.3 SC-514舒血管效應(yīng)的可逆性 SC-514組SC-514濃度較低時(shí)(5 μmol/L)血管張力為77.5%±2.2%，對照組為76.1%±3.1%，兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。增加SC-514濃度至15 μmol/L時(shí)血管張力為49.0%±2.7%，對照組為63.5%±1.8%，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。25 min后對兩組大鼠主動(dòng)脈環(huán)進(jìn)行充分沖洗后再以去氧腎上腺素1 μmL處理，SC-514組、對照組血管張力分別為72.6%±3.2% 、74.1%±1.1%，兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。表明SC-514對血管的舒張效應(yīng)是可逆的。

3 討論

目前已證實(shí)，除MLCK外還有多種激酶對MLC 第19號絲氨酸具有磷酸化作用，如Rho激酶、ILK、PAK和ZIPK。但關(guān)于這些激酶對血管平滑肌細(xì)胞MLC磷酸化作用尚存在爭議。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用Rho激酶抑制劑Y-27632對由花萼海綿體誘癌素A誘導(dǎo)的血管收縮和MLC的磷酸化并無拮抗作用，說明Rho激酶在血管平滑肌細(xì)胞中不是必需的MLC磷酸化激酶[6～9]。AV25和SM1是ZIPK的強(qiáng)效抑制劑，但它們并不能拮抗由肌球蛋白輕鏈磷酸化酶(MLCP)抑制引起的血管平滑肌收縮，從而排除ZIPK是血管平滑肌細(xì)胞中一類重要的MLC磷酸化激酶[10]。在哺乳動(dòng)物中PAK分為6種，對其中研究最深入的是PAK1，并已證實(shí)其在神經(jīng)細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和肺內(nèi)皮細(xì)胞中對MLC具有磷酸化作用。但沉默PAK1可誘導(dǎo)肌上皮細(xì)胞收縮，而不是舒張效應(yīng)[11]。對豚鼠血管平滑肌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，PAK1通過磷酸化可誘導(dǎo)血管舒張，進(jìn)而抑制MLCK活性[12]，這說明PAK1可能不是血管平滑肌細(xì)胞中重要的MLC磷酸化激酶。在食管平滑肌細(xì)胞中，通過使用Okadaic酸抑制MLCP活性時(shí)可顯著增強(qiáng)ILK活性；相反，當(dāng)使用ILK抗體時(shí)可抑制由Okadaic酸所產(chǎn)生的細(xì)胞收縮，這些現(xiàn)象說明ILK在細(xì)胞內(nèi)具有MLC磷酸化激酶活性[11]。

研究顯示，IKK2是一類重要的磷酸化激酶[13]。為此，我們采用體外主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測了IKK2對MLC的磷酸化激酶活性。我們體外實(shí)驗(yàn)初步通過IKK2抑制劑預(yù)處理小鼠，觀察對肌肉微血管的舒張作用，結(jié)果證明IKK2是MLC一類重要的縮血管激酶。其中IKK2抑制劑IMD-0354對胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，IMD-0354可顯著減輕由各種縮血管因素引起的主動(dòng)脈環(huán)的收縮，包括去氧腎上腺素、KCl、U-46619、離子霉素、花萼海綿體誘癌素A。IKK2抑制劑SC-514可通過對血管平滑肌細(xì)胞的凋亡作用產(chǎn)生舒血管效應(yīng)，且其對血管的舒張作用可完全被逆轉(zhuǎn)，從而排除SC-514對血管的舒張效應(yīng)是通過降低血管平滑肌細(xì)胞活性所致。此外，已有文獻(xiàn)報(bào)道IKK2抑制劑可誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡的發(fā)生[14]。

綜上所述，除MLCK外還有多種激酶對MLC第19號絲氨酸具有磷酸化作用，這些激酶主要有Rho激酶、ILK、PAK和ZIPK。但關(guān)于這些激酶對血管平滑肌細(xì)胞MLC磷酸化作用尚存在爭議，且支持這些激酶在血管平滑肌細(xì)胞中有類似作用的證據(jù)極少。本研究證實(shí)IKK2亦具有MLCK縮血管作用的磷酸激酶活性，其抑制劑有舒血管作用。